【摘要】：蚜蟲是世界性的農(nóng)作物害蟲,其不僅刺吸植物汁液掠奪植物營養(yǎng)、分泌蜜露導(dǎo)致煤污病的發(fā)生,還可傳播多種植物病毒病,對農(nóng)作物造成嚴(yán)重危害。蚜蟲不僅體型小,而且生活周期短、繁殖能力驚人,一年能繁殖20個世代左右,這些特點(diǎn)致使農(nóng)藥的頻繁及不合理使用的情況加重,導(dǎo)致對多種農(nóng)藥具有抗性的高抗品種出現(xiàn),從而使蚜蟲的防治工作更加困難。因而,蚜蟲的防治工作仍然任重而道遠(yuǎn),尋求一種有效的、持久的和環(huán)保的防治蚜蟲的方法一直是廣大植保工作者的目標(biāo)。而利用寄主植物本身對蚜蟲的抗性防治蚜蟲被認(rèn)為是一種有效而且環(huán)境友好型的控制蚜蟲方式,因而受到人們的普遍重視。但隨著抗蚜基因的大范圍持續(xù)使用,某些植物抗蚜基因?qū)ρ料x失去抗性,這暗示著蚜蟲的防治工作遲早面臨更為嚴(yán)重的考驗(yàn)。因而,不斷挖掘新的抗蚜基因,了解植物和蚜蟲間相互作用的分子機(jī)理,充分利用作物抗蚜性,對于在持久的生產(chǎn)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)對蚜蟲的有效治理具有十分重要的意義。植物ROP/RAC蛋白屬于Rho家族GTP酶的亞家族,它被認(rèn)為是一種全能的分子開關(guān),可調(diào)節(jié)各種植物發(fā)育過程,并對多種非生物脅和生物脅迫產(chǎn)生防御性反應(yīng)。但是,它們是否具有抗蟲性尚未報道。故我們在構(gòu)建棉蚜誘導(dǎo)的雞腳紅葉棉葉片的抑制差減雜交cDNA文庫的基礎(chǔ)上克隆了1個ROP/RAC家族的一個新成員GhRac6,采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對其在植物防御反應(yīng)中功能及抗蚜機(jī)理進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果如下:(1)以雞腳紅葉棉為材料克隆了棉花基因GhRac6(MG787184),GhRac6ORF的長度為636bp,編碼211個氨基酸。其等電點(diǎn)為9.028,預(yù)測的蛋白質(zhì)分子量為23,338.97 Da。(2)同源序列比對分析表明,GhRac6與其他植物物種的ROPs具有高度序列相似性(93.25%)。GhRac6和其他植物ROP蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析表明GhRac6與GhRac2的關(guān)系最密切,而與PeARAC8和cARAC8的關(guān)系較疏遠(yuǎn)。(3)經(jīng)棉蚜取食誘導(dǎo)后,GhRac6的轉(zhuǎn)錄水平在棉花的葉和莖中被抑制,GhRac9的轉(zhuǎn)錄水平只在棉花的葉中被抑制,但蚜蟲唾液誘導(dǎo)后,GhRac6和GhRac9的轉(zhuǎn)錄水平在棉花的葉中均顯著上調(diào)。GhRac1和GhRac2的轉(zhuǎn)錄水平在蚜蟲取食前期也被顯著抑制,但蚜蟲唾液誘導(dǎo)后無明顯變化。(4)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了GhRac6的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。選取其中Line1,Line2和Line3三個株系進(jìn)行抗蟲性試驗(yàn),無論是對桃蚜的選擇性試驗(yàn)還是非選擇性試驗(yàn),轉(zhuǎn)基因擬南芥上蚜蟲的數(shù)量都少于野生型擬南芥上蚜蟲的數(shù)量。對蚜蟲蜜露分泌量的測定實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)基因擬南芥Line3上蚜蟲的蜜露分泌量明顯低于野生型擬南芥上蚜蟲的蜜露分泌量,這些結(jié)果表明GhRac6的過量表達(dá)可以提高擬南芥對桃蚜的抗性。(5)為了闡述GhRac6提高擬南芥抗蚜性的機(jī)理,轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)可溶性糖和脯氨酸含量,苯丙氨酸解氨酶活性,過氧化氫酶的活性以及葉片胼胝質(zhì)的積累被檢測。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥中可溶性糖含量和脯氨酸含量在一定程度上分別高于野生型;PAL和CAT在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的活性也高于野生型;轉(zhuǎn)基因擬南芥中的胼胝質(zhì)沉積比野生型更多。(6)GhRac6和GhRac9在棉花植株中的瞬時表達(dá)抗蟲試驗(yàn)表明過量表達(dá)GhRac6和GhRac9的棉花葉片上蚜蟲數(shù)量低于對照植物的蚜蟲數(shù)量,且達(dá)到顯著水平。(7)為了闡述GhRac6和GhRac9提高棉花抗蚜性的機(jī)理,檢測了CAT、PPO、POD、PAL、NPR1、EDS1基因的轉(zhuǎn)錄水平,瞬時過表達(dá)GhRac6棉花葉片中POD、PPO、PAL和EDS1的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào),且POD和PAL達(dá)到極顯著水平;瞬時過表達(dá)GhRac9棉花葉片中,CAT、POD、PPO和PAL的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào),且CAT、PPO和PAL達(dá)到極顯著水平。
【學(xué)位授予單位】：長江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S435.622.1
【圖文】：

雞腳紅葉棉總RNA電泳圖（M：DNAMarker2000，1:棉花總RNA）

棉花基因 GhRac6 的克隆及 pMD 18T-GhRac6 菌落檢測（A）棉花基B）pMD 18T-GhRac6 菌落 PCR 檢測（M：DNA Marker 2000, 1-3:目 Cloning of cotton gene GhRac6 and detection of pMD 18T GhRac6 bactne GhRac6（B）pMD 18T-GhRac6 bacteria PCR test (M: DNA Marker gene)Rac6 的測序結(jié)果與序列分析D 18-GhRac6 的陽性克隆送至南京金斯瑞生物科技技術(shù)有限c6 ORF 的長度為 636 bp，編碼 211 個氨基酸。其等電點(diǎn)為分子量為 23,338.97 Da（圖 2-3）。同源序列比對分析表明，

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本文編號：2715710