【摘要】：翻譯控制腫瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)是一種序列上高度保守的蛋白,廣泛存在于動物、植物以及真菌體內(nèi),具有多種生物功能,包括調(diào)節(jié)細胞周期的進程和惡性轉(zhuǎn)移、鈣結(jié)合蛋白、細胞外組胺釋放蛋白、抗凋亡等。黑腹果蠅(Drosophila rrelangaster)因其清晰的遺傳背景以及便捷的實驗操作,被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等研究領(lǐng)域,是遺傳學(xué)研究的重要模式生物。我們實驗室前期實驗發(fā)現(xiàn),小菜蛾的溴氰菊酯抗性品系中TCTP的表達水平與敏感品系相比明顯提高,但是TCTP是否與溴氰菊酯抗性相關(guān),目前還沒有文獻報道。本研究對TCTP在溴氰菊酯、對硫磷和西維因應(yīng)激中的作用及其與溴氰菊酯耐受的關(guān)系進行了初步探索,主要結(jié)果如下:1)用不同濃度的溴氰菊酯、對硫磷和西維因分別處理果蠅細胞48 h,RT-PCR測定果蠅Kc細胞中TCTP的表達水平。結(jié)果表明:在不同種類殺蟲劑的處理下,細胞內(nèi)TCTP基因的表達水平均有升高,其中溴氰菊酯的影響最明顯。接著選取適宜濃度的溴氰菊酯,分別將果蠅細胞處理0h,12 h,24 h,36 h,48 h,60 h,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在處理24 h時TCTP的表達量最高。2)為了進一步驗證TCTP在溴氰菊酯應(yīng)激下對細胞的保護作用,我們克隆TCTP基因的全長并轉(zhuǎn)染進果蠅細胞,使用RT-PCR技術(shù)和Western blot來檢測其轉(zhuǎn)染率,并用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結(jié)果表明:成功過表達的果蠅細胞與對照組細胞相比細胞的凋亡率明顯下降,即對溴氰菊酯的抗性有明顯的提高;而用dsRNA敲低TCTP在果蠅細胞中的表達,細胞的凋亡率顯著上升,說明對溴氰菊酯的抗性明顯下降。3)將溴氰菊酯抗性和敏感性品系小菜蛾幼蟲分別提取RNA,并解剖頭、中腸、脂肪體和肌肉四種組織提RNA,用RT-PCR檢測TCTP基因的表達量,結(jié)果顯示抗性品系整體TCTP表達量高于敏感品系,且頭和脂肪體的TCTP基因表達量明顯高于敏感性品系,抗性品系中TCTP呈現(xiàn)組成型高水平表達。上述結(jié)果表明:TCTP基因表達水平與昆蟲對殺蟲劑耐受之間存在一定的聯(lián)系。TCTP基因的高表達能增強果蠅Kc細胞對溴氰菊酯的抗性能力,抗溴氰菊酯品系小菜蛾細胞中TCTP組成型高表達。因此,我們推論TCTP基因可能是與溴氰菊酯抗藥性相關(guān)的候選基因,但是關(guān)于TCTP在溴氰菊酯抗藥性中的作用機理仍需要深入的探究。
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S433
【圖文】：

將ＲＮＡ用一步法反轉(zhuǎn)錄成ｃＤＮＡ進行ＲＴ－ＰＣＲ實驗。實驗結(jié)果表明，處理不同逡逑時間的細胞的ｒｃｒｐ的表達量具有明顯的差異，并且和對照組相比ｒｃｒｐ表達量逡逑顯著提高，并且在２４邋ｈ時ＴＣ２Ｔ的表達量最高（圖２．２）。逡逑４０邋ｆ邐＊逡逑３．５邋－邐丨逡逑■邐■逡逑■邋－邋ｉ逡逑ｍｉｌＩＩ邋ａ逡逑0邐１２邐２４邐３６邐４８邐６０逡逑Ｔｉｍｅ邋ｏｆ邋ｄｒｕｇ邋ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ邋（ｈ）逡逑圖２．２相同濃度條件下溴氰菊酯誘導(dǎo)不同時間后ｒＣ７Ｔ基因的表達水平逡逑＊邋代表／？＜0．0５。逡逑Ｆｉｇ．邋２．２邋ｍＲＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＴＣＴＰ邋ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋ｗｉｔｈ邋ＤＭ邋ｆｏｒ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｍｅｓ逡逑＊邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｐ＜０．０５．逡逑２．３．３不同濃度溴氰菊酯處理細胞的存活率逡逑分別用不同濃度的溴氰菊酯處理細胞２４邋ｈ，然后使用流式細胞儀來檢測不同逡逑濃度刺激下細胞的凋亡率。結(jié)果顯示，在２０邋ｐｐｍ濃度時，細胞的凋亡率最�。▓D逡逑２．３），該濃度處理下基因ｒＣ７Ｐ的表達量最高，預(yù)示７ＩＴＰ在溴氰菊酯耐受中發(fā)逡逑揮作用。逡逑１４逡逑

將ＲＮＡ用一步法反轉(zhuǎn)錄成ｃＤＮＡ進行ＲＴ－ＰＣＲ實驗。實驗結(jié)果表明，處理不同逡逑時間的細胞的ｒｃｒｐ的表達量具有明顯的差異，并且和對照組相比ｒｃｒｐ表達量逡逑顯著提高，并且在２４邋ｈ時ＴＣ２Ｔ的表達量最高（圖２．２）。逡逑４０邋ｆ邐＊逡逑３．５邋－邐丨逡逑■邐■逡逑■邋－邋ｉ逡逑ｍｉｌＩＩ邋ａ逡逑0邐１２邐２４邐３６邐４８邐６０逡逑Ｔｉｍｅ邋ｏｆ邋ｄｒｕｇ邋ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ邋（ｈ）逡逑圖２．２相同濃度條件下溴氰菊酯誘導(dǎo)不同時間后ｒＣ７Ｔ基因的表達水平逡逑＊邋代表／？＜0．0５。逡逑Ｆｉｇ．邋２．２邋ｍＲＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＴＣＴＰ邋ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋ｗｉｔｈ邋ＤＭ邋ｆｏｒ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｍｅｓ逡逑＊邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｐ＜０．０５．逡逑２．３．３不同濃度溴氰菊酯處理細胞的存活率逡逑分別用不同濃度的溴氰菊酯處理細胞２４邋ｈ，然后使用流式細胞儀來檢測不同逡逑濃度刺激下細胞的凋亡率。結(jié)果顯示，在２０邋ｐｐｍ濃度時，細胞的凋亡率最�。▓D逡逑２．３），該濃度處理下基因ｒＣ７Ｐ的表達量最高，預(yù)示７ＩＴＰ在溴氰菊酯耐受中發(fā)逡逑揮作用。逡逑１４逡逑

【參考文獻】

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本文編號：2715948