【摘要】：水稻是世界上最重要的糧食作物之一,它廣泛的適應性和高產(chǎn)性能使水稻生產(chǎn)具有巨大社會意義和重要的戰(zhàn)略意義,在糧食危機愈演愈烈和人口總數(shù)不斷增長的歷史背景下,全世界對水稻生產(chǎn)的期望也越來越高。據(jù)預測,到2050年,水稻產(chǎn)量在現(xiàn)有基礎(chǔ)上翻一番才能基本滿足不斷增長人口需求。水稻病害是造成稻谷產(chǎn)量下降的主要原因之一,如水稻三大病害之一的稻瘟病每年給水稻造成11-30%的產(chǎn)量損失。盡管化學防治對水稻病害效果顯著,但由于施用時期局限、病原菌抗藥性增強、對環(huán)境造成嚴重污染和對稻米品質(zhì)的關(guān)注提高,一定程度上限制了化學藥劑的使用。與之相反,抗病水稻品種的選育及大面積推廣卻是多年來被證明為防治病害最經(jīng)濟、最有效和最安全的解決途徑。本論文研究內(nèi)容涉及植物生理學、生物化學、定量蛋白值組學等技術(shù),研究內(nèi)容主要包括(1)通過體外標記技術(shù)(iTRAQ)結(jié)合高通量的質(zhì)譜鑒定平臺(LC-MS/MS),對水稻響應稻瘟菌侵染脅迫時,不同時間段葉片樣本蛋白質(zhì)表達進行研究;(2)對不同抗性水稻品種響應稻瘟菌侵染脅迫時葉片樣本蛋白質(zhì)表達進行定量研究;(3)通過生物信息學手段結(jié)合實驗驗證,旨在找到稻瘟菌侵染水稻時,水稻發(fā)生差異表達的蛋白,從而從分子水平闡明抗病性機制,為培育優(yōu)質(zhì)、抗病的水稻新品種奠定基礎(chǔ),推動水稻抗稻瘟菌的分子機制研究。本論文的主要結(jié)果是:1)在水稻對稻瘟菌侵染不同時間脅迫應答的定量蛋白質(zhì)組學研究中,我們提取谷梅2號在稻瘟菌(Guy11)侵染0小時、24小時、48小時后的葉片蛋白,進行定量、酶解及標記處理,再根據(jù)肽段特征,將復雜肽段進行SCX柱的初級分離,最后通過LC-MS/MS高通量質(zhì)譜鑒定平臺(ABSECXTripleTOFTM4600)進行圖譜采集。通過ProteinPilot4.5軟件(ABSCIEX,FosterCity)針對280,528條Oryzasativa蛋白序列進行搜索。數(shù)據(jù)采集時,對每個組分進行兩次技術(shù)重復,即共采集20個組分,每10個組分采集圖譜經(jīng)過軟件整合到一個文件中,每個文件分別針對Oryzasativa庫進行比對搜索,兩次結(jié)果表為Repeat 1 和 Repeat2。結(jié)果顯示,Repeat 1 在 FDR 為 1.0%時,共鑒定到 33,373 Spectral,15,835條肽,1,604 個蛋白。Repeat2 在 FDR 為 1.0%時,共鑒定到 33,004 Spectral,15,800條肽,1,581個蛋白。取2個及2個以上肽段支持的蛋白作為分析的結(jié)果。結(jié)果表明,Repeat1共有1,234個蛋白,Repeat2共有1,210個蛋白。根據(jù)上述得到的結(jié)果,將兩次實驗得到的蛋白進行分類,分為上調(diào)和下調(diào),將ratio值大于1.2的標為上調(diào),小于0.8的標為下調(diào),去除只有一次鑒定到的且趨勢不一致的蛋白,剩余蛋白分為五組:在稻瘟菌侵染24小時和48小時后,蛋白表達量在兩個時間段都上調(diào)的一組共121個蛋白;稻瘟菌侵染24小時和48小時后,蛋白表達量有一時間段上調(diào)的一組共26個蛋白;稻瘟菌侵染24小時和48小時后,蛋白表達量有一時間段下調(diào)的一組共34個蛋白;稻瘟菌侵染24小時和48小時后,蛋白表達量有一時間段上調(diào)且另一時間段下調(diào)的一組共43個蛋白;稻瘟菌侵染24小時和48小時后,蛋白表達量兩個時間段都下調(diào)的一組共148個蛋白。對差異表達蛋白進行生物信息學分析、GO分類和KEGG-pathway分析,結(jié)果表明,這些差異表達蛋白共在79個通路中起著關(guān)鍵作用,參與較多的為光合作用途徑;對差異表達蛋白進行分泌蛋白分析,發(fā)現(xiàn)其中61個蛋白具有信號肽,可能為分泌蛋白。進行GO enrichment分析時,發(fā)現(xiàn)在TCA循環(huán)、NADP代謝過程、異構(gòu)酶活性等15個分類中有富集;我們還將這些蛋白進行網(wǎng)絡互作分析,通過string在線分析發(fā)現(xiàn),有314個功能被String數(shù)據(jù)庫收錄,分析顯示,這314個蛋白存在相互作用,有兩類蛋白發(fā)生聚類現(xiàn)象,對這些蛋白進行分析發(fā)現(xiàn)這兩類蛋白分別為:一類為光合相關(guān)蛋白,另一類為核糖體相關(guān)蛋白。這兩類蛋白在水稻中起著重要功能,光合相關(guān)蛋白參與光合作用,提供能量;核糖體蛋白與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。提示在稻瘟菌侵染水稻時,這兩類蛋白發(fā)生了變化,參與了水稻拮抗稻瘟菌的過程。在水稻受稻瘟菌侵染不同時間段表達差異的蛋白中,發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶抑制劑含量顯著上升。定量PCR分析結(jié)果表明,編碼胰蛋白酶抑制劑基因在mRNA水平也顯著上升。胰蛋白酶抑制劑是一類能夠抑制蛋白水解酶活性的蛋白質(zhì),該蛋白能與蛋白酶的活性部位和變構(gòu)部位結(jié)合,抑制酶的催化活性或阻止酶原轉(zhuǎn)化為有活性的酶。因此它具有防止體內(nèi)不必要的蛋白降解,調(diào)節(jié)蛋白代謝及調(diào)節(jié)各種蛋白酶生理活性的功能。很多植物的胰蛋白酶抑制劑還具有抑制某些病原微生物及某些昆蟲體內(nèi)蛋白酶的作用,是植物體的一種自然防御體。有趣的是我們在篩選差異表達蛋白質(zhì)時,發(fā)現(xiàn)一個putative dioscorin的蛋白,dioscorin為山藥儲藏蛋白。有研究表明,該蛋白有胰蛋白酶抑制劑活性,在我們鑒定的結(jié)果中也顯示該蛋白在水稻遭受稻瘟菌侵染時,表達量顯著提升,與胰蛋白酶抑制劑的趨勢是一致的。研究還表明,與光合作用密切相關(guān)的蛋白,如Rubisco的大亞基、Rubisco subunit binding-protein alpha subunit等,在水稻遭受稻瘟菌侵染時表達量急劇下降,而與能量代謝相關(guān)的蛋白,如 ATP synthase CF1 beta subunit,ATP synthase CF1 alpha chain,則在水稻遭受稻瘟菌侵染時表達量上調(diào)。2)在不同抗性水稻對稻瘟菌侵染脅迫應答的定量蛋白質(zhì)組學研究中,我們對提取的稻瘟菌(Guy11)侵染24小時的抗稻瘟菌水稻(谷梅2號)和不抗稻瘟菌水稻(黑谷)的葉片蛋白進行定量、酶解及標記處理,再根據(jù)肽段特征,將復雜肽段進行SCX柱的初級分離,最后通過LC-MS/MS高通量質(zhì)譜鑒定平臺(ABSECXTripleTOFTM4600)進行圖譜采集。通過 ProteinPilot4.5 軟件(ABSCIEX,FosterCity)針對 Oryzasativa 蛋白序列進行搜索。在FDR為1.0%時,取2個及2個以上肽段支持的蛋白進行分析。兩次重復分別鑒定到1,196和1,180個蛋白。將ratio值大于1.2的標為上調(diào),小于0.8的標為下調(diào),去除只有一次鑒定到的且趨勢不一致的蛋白,在抗性水稻種得到上調(diào)表達的蛋白220個,下調(diào)表達的蛋白240個。對差異表達蛋白進行生物信息學分析、GO分類和KEGG-pathway分析,結(jié)果表明,這些差異表達蛋白共在81個通路中起著關(guān)鍵作用,參與較多的為糖異生/糖酵解途徑。進一步將差異表達蛋白進行分泌蛋白分析,發(fā)現(xiàn)其中68個蛋白具有信號肽,可能為分泌蛋白。進行GO enrichment分析時,發(fā)現(xiàn)在光合作用、羧酸代謝過程,葉綠體組成等11個分類中有富集;我們還將這些蛋白進行網(wǎng)絡互作分析,通過string在線分析發(fā)現(xiàn),有385個功能被String數(shù)據(jù)庫收錄,這385個蛋白存在相互作用,有兩類蛋白發(fā)生聚類現(xiàn)象,對這些蛋白進行分析發(fā)現(xiàn)這兩類蛋白分別為:一類為能量代謝相關(guān)蛋白,另一類為核糖體相關(guān)蛋白。這與前面GO enrichment分析的結(jié)果是一致的,不同抗性的水稻在能量代謝和轉(zhuǎn)錄合成存在差異,深入研究這些差異功能,為闡明水稻抗稻瘟菌的分子機制做出貢獻。在研究內(nèi)容1)中我們發(fā)現(xiàn),抗稻瘟菌谷梅2號在遭受稻瘟菌侵染時,胰蛋白酶抑制劑的表達顯著提升,在質(zhì)譜分析結(jié)果和定量PCR結(jié)果一致。在不同抗性水稻對稻瘟菌侵染脅迫應答機制研究中,我們發(fā)現(xiàn)抗稻瘟菌株水稻在遭遇稻瘟菌侵染時,胰蛋白酶抑制劑的表達量比不抗稻瘟菌株(黑谷)顯著提升,這一結(jié)果與Peng等在番茄葉片遭受致病疫霉時結(jié)果是一致的。根據(jù)本研究的結(jié)果,我們認為稻瘟菌在侵染水稻時,可能需要大量水解蛋白以提供能量,水稻為了拮抗稻瘟菌的侵入,高表達胰蛋白酶抑制劑,從而抑制胰蛋白酶的活性,而具有胰蛋白酶抑制劑活性dioscorin(山藥儲藏蛋白)也急劇提升,從而達到抑制胰蛋白酶的活性,最終達到拮抗稻瘟菌的侵染。光合代謝相關(guān)的蛋白 Rubisco activase large isoform precursor 和 Rubisco subunit binding-protein alpha subunit表達在抗稻瘟菌株中比感染株中顯著下調(diào),且兩個蛋白在抗稻瘟菌株中比感染株中顯著下調(diào);由此,我們推測,稻瘟菌侵染水稻,抗稻瘟菌株水稻通過下調(diào)表達 Rubisco activase large isoform precursor 和 Rubisco subunit binding-protein alpha subunit,從而降低抗稻瘟菌水稻葉片的光合作用,拮抗稻瘟菌的侵入。能量代謝相關(guān)蛋白 ATP synthase CF1 beta subunit,ATP synthase CF1 alpha chain 在不同抗性水稻遭遇稻瘟菌侵染下,ATP synthase CFI beta subunit有限上調(diào),而ATP synthase CF1 alpha chain基本沒有變化。
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S435.111.41
【圖文】：

ＳＡＢＰｓ”復合體，接著將信息傳遞給胞內(nèi)第二信使如比０２等，信號會通過自我反饋機制放逡逑大，在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導引發(fā)超敏反應（ＨＲ），同時引起胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變，激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄逡逑因子的活化與互作，最終誘導ＰＲ基因表達及系統(tǒng)獲得性抗性的產(chǎn)生（圖１．２）。逡逑邐邐邋ＳＡＷ＊逡逑Ｈ；Ｏｊ邋Ｈｉ0＞邋Ｗ逡逑，邐￥ａｂ�。捱姡慑义希愤姙担嚎乖� ｖ＇老＇逡逑Ｉ邐ＨＳｖＪＭｋ／ＳＨ邐ＨＳ邋／邋ＳＨ逡逑ｍ邋ｈｖＷｓｈ邋yU逡逑：？＇廔，３＾逡逑１邋ＰＯ邋ｃｉｃｍｃｎＴＴ邋｛邋ｉ？－ｉ邋｜邐｜邋Ｗ邋ｂｏｘ邋｜邐［邐＾邋ＰＢ邋ｅｌｅｍｅｎｔ邋｜邐１邋ａｓ－ｉ邋＼邐｜邋Ｗ－ｂｏｘ邋１邐１邐＼逡逑￣：＝－＾ｘ邋＾邋—邋－１—逡逑ｌ邐，＿＿＿．逡逑、＾邋［邋ＰＢ邋ｅｌｅｒｗＣＴｔ邋｜邋［邋ａ＾ｌ邋１邐［邋Ｗ－ｂｏｘ邋１邋１邐｜逡逑圖１．２水楊酸信號轉(zhuǎn)導途徑示意圖，圖片引自周瑩等的論文（周瑩ｅｔａｌ．，２００７）。逡逑Ｆｉｇ邋１．２邋Ｔｈｅ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＳＡ邋ｓｉｇｎａｌ邋ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ邋ｐａｔｈｗａｙ（周堂邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００７）．逡逑９逡逑

技術(shù)的第一步。質(zhì)譜技術(shù)中常應用到的電離方式有：電噴霧離子源（ＥＳＩ）、大氣壓化學電逡逑離源（ＡＰＣＩ）、基質(zhì)輔助激光解析電離（ＭＡＬＤＩ）和大氣壓光電離源（ＡＰＰＩ）。檢測生物逡逑大分子的生物質(zhì)譜，主要應用到ＥＳＩ和ＭＡＬＤＩ離子源軟電離技術(shù)（圖１．３）。電噴霧離子逡逑源（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ邋Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ，ＥＳＩ）與液相色譜聯(lián)用（Ｐａｉｋｅｔａｌ．，邋２０１２），液體在色譜分離后經(jīng)逡逑噴針噴出處施加高電壓，產(chǎn)生高電場，輔助氮氣，使流出的液體霧化成細小的帶電液滴，逡逑細小液滴進一步去溶劑后實現(xiàn)離子化，形成大量帶一個電荷或多個電荷的離子，即庫倫爆逡逑炸，使分析物以氣相形式進入質(zhì)量檢測器。由于ＥＳＩ源產(chǎn)生的為多電荷離子，使質(zhì)荷比降逡逑低，大大擴展了生物大分子的檢測范圍；基質(zhì)輔助激光解吸電離（Ｍａｔｒｉｘ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ邋Ｌａｓｅｒ逡逑Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ，邋ＭＡＬＤＩ）邋（Ｍａｒｇｕｅｒａｔｅｔａｌ．，２０１２）技術(shù)是將待測樣品與基質(zhì)混合，樣逡逑品均勻的分散在基質(zhì)中并形成結(jié)晶，激光作用于混合有樣品的晶體，化學基質(zhì)吸收光子被逡逑激活

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王勇為;;LTQ-Orbitrap Velos雙分壓線性阱和靜電場軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜性能及應用[J];現(xiàn)代儀器;2010年05期

2 楊勤忠;林菲;馮淑杰;王玲;潘慶華;;水稻稻瘟病抗性基因的分子定位及克隆研究進展[J];中國農(nóng)業(yè)科學;2009年05期

3 王炎欽;姜玉新;;激發(fā)子誘導的信號通路的研究進展[J];科技通報;2007年03期

4 周瑩;壽森炎;賈承國;汪俏梅;;水楊酸信號轉(zhuǎn)導及其在植物抵御生物脅迫中的作用[J];自然科學進展;2007年03期

5 張欣欣,柳參奎;水稻線粒體ATP合成酶小亞基基因的鑒定及解析[J];分子植物育種;2003年Z1期

6 陳慧勤,趙淑清;植物抗病反應及系統(tǒng)獲得抗性研究進展[J];山西農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版);2003年03期

7 王生榮,朱克恭;植物系統(tǒng)獲得抗病性研究進展[J];中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報;2002年02期

8 丁秀英,張軍,蘇寶林,徐惠風;水楊酸在植物抗病中的作用[J];植物學通報;2001年02期

9 何月秋,唐文華;水稻抗稻瘟病遺傳研究進展[J];云南農(nóng)業(yè)大學學報;2000年04期

10 吳建利,莊杰云,柴榮耀,樊葉揚,金敏忠,李德葆,鄭康樂;水稻抗穗瘟基因的分子定位[J];植物病理學報;2000年02期

本文編號：2715117