【摘要】：西花薊馬Frankliniella occidentalis是農(nóng)業(yè)和園藝上的重要害蟲,為典型的銼吸式口器害蟲,為害嚴(yán)重,造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。二斑葉螨Tetranychus urticae與西花薊馬同為菜豆上的重要害蟲,且常常同時發(fā)生共同危害寄主植物。本文旨在研究西花薊馬和二斑葉螨為害后菜豆不同部位葉片防御酶活性的變化,以揭示菜豆植株的系統(tǒng)抗性。并通過轉(zhuǎn)錄組(RNAseq)分析西花薊馬取食二斑葉螨為害的菜豆植株第1代和第7代后的差異,揭示西花薊馬適應(yīng)菜豆誘導(dǎo)抗性的分子機(jī)制。以期為進(jìn)一步研究西花薊馬與二斑葉螨的競爭,以及為西花薊馬的綜合治理奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1、西花薊馬和二斑葉螨取食對菜豆防御酶活性的影響分別以西花薊馬和二斑葉螨取食,以及機(jī)械損傷處理菜豆中部葉片6 h、24 h、48 h、72h和96 h后,測定菜豆植株中部處理葉片以及上部和下部未處理葉片的抗氧化酶和防御酶活性的變化。1.1、對抗氧化酶POD、CAT和SOD活性的影響西花薊馬和二斑葉螨取食以及機(jī)械損傷處理后,過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性在處理的菜豆中部葉片發(fā)生了明顯變化,但西花薊馬和二斑葉螨造成酶活性的變化趨勢不同。與對照相比,中部葉片POD活性不論在何種處理下均是先升高后恢復(fù)至對照水平。POD活性在二斑葉螨取食24 h時最先達(dá)到最大值,而對機(jī)械損傷和西花薊取食的響應(yīng)較遲,直到48 h后才達(dá)到峰值。中部葉片CAT活性對機(jī)械損傷和2種害蟲取食的響應(yīng)存在差異,機(jī)械損傷24 h時CAT活性明顯升高,而CAT活性對2種害蟲取食的應(yīng)答較早,6 h明顯升高,但隨時間的延長,CAT活性的變化趨勢不同。中部葉片SOD活性在不同處理下變化較大,在機(jī)械損傷誘導(dǎo)下僅在96 h明顯升高;二斑葉螨取食24h以后SOD活性均明顯升高;但西花薊取食后,SOD活性在一定時間內(nèi)受到明顯的抑制。3種酶活性在處理植株未受害的上部和下部葉片也發(fā)生了明顯的變化,不同處理后在上部未受害葉片中POD活性被抑制或被激發(fā),而在下部葉片不同處理下均升高。CAT活性不論在上部還是下部未受害葉片,在不同處理的某些時間下均被明顯激發(fā)。SOD活性在機(jī)械損傷以及二斑葉螨取食后的上部和下部未受害葉片一定時間內(nèi)均被明顯激發(fā)。但SOD活性在西花薊馬取食后,在一定時間內(nèi)被抑制。1.2、對防御酶PPO和PAL活性的影響西花薊馬和二斑葉螨取食及機(jī)械損傷處理后,中部受害葉片的多酚氧化酶(PPO)活性均是在6 h明顯升高,但隨時間的延長,不同誘導(dǎo)處理下PPO活性的變化不同。苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性經(jīng)機(jī)械損傷處理48 h后被明顯激活,而二斑葉螨和西花薊馬取食后,中部葉片PAL活性應(yīng)答較早,分別在6 h和24 h被誘導(dǎo)明顯升高,且分別達(dá)到活性最大值,為對照的1.8和2.8倍。上部和下部未受害葉片在2種害蟲取食后PPO活性均在6 h明顯升高;但機(jī)械損傷處理后,上部葉片PPO活性在48 h才被明顯激活。PAL活性在機(jī)械損傷處理下,也發(fā)現(xiàn)菜豆上部和下部葉片被激活的時間也均較害蟲取食晚;且害蟲中以二斑葉螨取食后PAL活性激活最快,上部和下部葉片均在6 h達(dá)到最大值,分別為對照的2.8和5.1倍。以上結(jié)果說明害蟲取食菜豆葉片產(chǎn)生系統(tǒng)防御,并且菜豆植株的系統(tǒng)防御與害蟲種類有關(guān)。2、西花薊馬轉(zhuǎn)錄組分析利用BGISEQ-500轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對菜豆豆莢、健康菜豆植株和二斑葉螨危害植株飼養(yǎng)的西花薊馬種群進(jìn)行RNA-seq測序和分析,共獲得102,696個Unigenes基因,其中有56.55%的基因在數(shù)據(jù)庫中獲得注釋(58,077個),在KOG、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫中分別有42,155、7,495和42,740個基因獲得注釋。其中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制最多有10,139個Unigenes基因,碳水化合物轉(zhuǎn)運和新陳代謝以及次級代謝產(chǎn)物生物合成有3,069個,運輸和分解代謝注釋上的基因有1,049個,防御機(jī)制有3,402個。大部分差異基因富集在生物過程和細(xì)胞組分中的26和20個terms板塊,分別有15,108和13,399個。Pathway代謝通路分析發(fā)現(xiàn),在傳染性病害、代謝和免疫系統(tǒng)相關(guān)通路富集有大量基因,參與西花薊馬適應(yīng)寄主抗性的生長和發(fā)育過程。2.1、西花薊馬取食不同處理菜豆植株的差異基因表達(dá)分析以健康植株和二斑葉螨為害的菜豆植株分別飼養(yǎng)西花薊馬第1代和第7代,分析同一齡期不同世代轉(zhuǎn)錄組的差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn),第1代西花薊馬2齡若蟲上調(diào)基因有485條,下調(diào)基因有408條;西花薊馬雌成蟲的上調(diào)基因和下調(diào)基因分別為78和440條。到第7代后,西花薊馬2齡若蟲和雌成蟲總獲得531條差異基因,2齡若蟲上調(diào)和下調(diào)基因分別有145和110條,而雌成蟲上調(diào)和下調(diào)基因分別為69和207條。且這些差異基因主要富集在細(xì)胞組分和生物過程。將不同處理后獲得的差異基因富集到GO數(shù)據(jù)庫,這些差異基因中大部分參與了西花薊馬的代謝過程、細(xì)胞過程、細(xì)胞及細(xì)胞部分、催化活性和結(jié)合等生理過程。2.2、取食同一處理菜豆的西花薊馬轉(zhuǎn)錄組分析西花薊馬取食同一種處理寄主(健康菜豆或二斑葉螨誘導(dǎo)菜豆)并繁殖第1代和第7代,結(jié)果發(fā)現(xiàn)取食健康菜豆植株后,2齡若蟲上調(diào)基因和下調(diào)基因分別獲得1101和925條,而雌成蟲僅有46條和371條。當(dāng)取食二斑葉螨為害的菜豆植株后,西花薊馬2齡若蟲的差異基因數(shù)明顯增多,2齡若蟲的上調(diào)基因和下調(diào)基因分別有8534和1698條,而雌成蟲的差異基因僅有319和1377條。將西花薊馬取食同一處理菜豆不同世代的差異基因比對到GO數(shù)據(jù)庫,注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分差異基因參與了西花薊馬的代謝過程、細(xì)胞過程、細(xì)胞及細(xì)胞部分、催化活性以及結(jié)合等生理過程。2.3、差異基因Pathyway通路分析將取食相同處理菜豆不同世代,以及取食不同處理菜豆同一世代的西花薊馬,進(jìn)行差異基因Pathyway通路富集分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)獲得的差異基因均主要富集在代謝和有機(jī)系統(tǒng)模塊,其中大部分基因參與了昆蟲的碳水化合物代謝、脂肪代謝、免疫系統(tǒng)和消化系統(tǒng)。西花薊馬取食二斑葉螨處理菜豆獲得的差異基因數(shù)明顯比取食健康菜豆的差異基因數(shù)多。說明西花薊馬在適應(yīng)二斑葉螨取食誘導(dǎo)菜豆的過程中,激活了西花薊馬體內(nèi)代謝、免疫系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等等相關(guān)的應(yīng)答反應(yīng),以適應(yīng)不同誘導(dǎo)的菜豆抗性。3、差異基因的篩選根據(jù)GO和KEGG注釋結(jié)果篩選獲得西花薊馬在適應(yīng)取食健康菜豆和二斑葉螨為害菜豆過程中消化酶、解毒酶和免疫系統(tǒng)的差異表達(dá)基因,其中消化酶系:如脂肪酶、絲氨酸蛋白酶、羧肽酶、胰蛋白酶和氨基肽酶等,分別獲得240、99、88、85和78條;解毒酶:細(xì)胞色素P450s大家氧化酶系、酯酶類(羧酸酯酶)、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶,分別有291、131(27)、9和5條;在西花薊馬的免疫系統(tǒng),有99、28、22、15和7條差異基因分別屬于絲氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑、肽聚糖識別蛋白、清道夫受體和C型凝集素。說明二斑葉螨侵染后誘導(dǎo)激活了西花薊馬體內(nèi)的消化代謝、解毒代謝和免疫系統(tǒng)相關(guān)基因的應(yīng)答,其中脂肪酶、P450s和絲氨酸蛋白酶是此過程中主要應(yīng)答基因。
【圖文】：

（8） 13600 rpm，4℃離心 20 min。（9） 吸棄上清，加入 1 mL75%乙醇，用移液器吹洗沉淀。（10） 10000rpm，4℃ 離心 3min，吸棄上清，短暫離心，吸去殘留液體，晾干 3-5min。（11） 用 30-100 μLDEPC 水或者 RNase-free 水溶解沉淀。提取 RAN 后用 2100 生物分析儀對各處理 RNA 進(jìn)行質(zhì)量檢測，質(zhì)量合格后用于轉(zhuǎn)錄組上機(jī)測序。1.3.3 轉(zhuǎn)錄組分析流程首先，，過濾掉低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基 N 含量過高的 reads，過濾后的數(shù)據(jù)稱為clean reads。然后對 clean reads 進(jìn)行組裝得到 Unigene，之后對 Unigene 進(jìn)行功能注釋、SSR檢測，對每個樣品計算 Unigene 表達(dá)水平。最后，對于多個樣品根據(jù)需求檢測不同樣品之間的差異表達(dá)基因，并對差異表達(dá)基因做深入的聚類分析和功能富集分析。

圖 2.2 組裝過程Figure 2.2 The process of assembly1.3.7 Unigene 功能注釋NT、NR、GO、KOG、KEGG、SwissProt 以及 InterPro 都屬于功能性數(shù)據(jù)庫。我們使用Blastn（Altschul et al., 1990）對 Unigene 進(jìn)行 NT 注釋，使用 Blastx（Altschul et al., 1990）或 Diamond（Buchfinketal.,2015）對 Unigene 進(jìn)行 NR、KOG、KEGG 以及 SwissProt 注釋，使用 Blast2GO（Conesa et al., 2005）以及 NR 注釋結(jié)果進(jìn)行 GO 注釋，使用 InterProScan 5（Quevillon et al., 2005）進(jìn)行 InterPro 注釋。1.3.8 Unigene 表達(dá)量計算及差異基因分析使用 Bowtie 2（Langmead and Salzberg, 2012）將 clean reads 比對到 Unigene，然后使用RSEM（Li and Dewey, 2011）計算各個樣品的基因表達(dá)水平。根據(jù)需求，我們使用 DEseq2方法進(jìn)行差異基因檢測。DEseq2 方法基于負(fù)二項分布原理，本項目根據(jù) Love 等（2014）中描述的方法進(jìn)行 DEG 檢測，我們采用差異倍數(shù)在兩倍及以上且校正的 P 值小于等于 0.05 來
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S436.43

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳麗慧;帕提瑪·烏木爾汗;崔燕華;李勇;馮宏祖;;棉蚜取食對不同品種棉花防御酶活性的影響[J];新疆農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年10期

2 達(dá)麗婷;朱亞靈;宋麗雯;胡桂馨;王森山;;不同苜蓿品種對豌豆蚜中腸消化酶活性的影響[J];草業(yè)學(xué)報;2015年10期

3 陳澄宇;康志嬌;史雪巖;高希武;;昆蟲對植物次生物質(zhì)的代謝適應(yīng)機(jī)制及其對昆蟲抗藥性的意義[J];昆蟲學(xué)報;2015年10期

4 王國紅;曹彬;黃長禮;戈峰;;茄二十八星瓢蟲為害對不同基因型番茄葉內(nèi)三種抗性酶活性的影響[J];應(yīng)用昆蟲學(xué)報;2015年05期

5 王倩倩;王蕾;李克斌;曹雅忠;尹姣;肖春;;不同寄主植物對草地螟的營養(yǎng)作用及消化酶的影響[J];植物保護(hù);2015年04期

6 溫娟;郅軍銳;呂召云;李順欣;;西花薊馬對二斑葉螨為害后番茄的行為反應(yīng)及揮發(fā)物成分分析[J];應(yīng)用昆蟲學(xué)報;2015年04期

7 帕提瑪·烏木爾汗;陳麗慧;李勇;馮宏祖;;二斑葉螨取食后不同品種棉葉防御酶活力的變化[J];中國棉花;2015年06期

8 高杭;郅軍銳;張駿;牟峰;;西花薊馬對六種蔬菜的選擇性及受害蔬菜揮發(fā)物化學(xué)成分的變化[J];生態(tài)學(xué)雜志;2015年04期

9 禹海鑫;葉文豐;孫民琴;徐寧;婁少之;冉俊祥;婁永根;;植物與植食性昆蟲防御與反防御的三個層次[J];生態(tài)學(xué)雜志;2015年01期

10 劉若思;劉燕;王軍;呂玉峰;邊勇;張麗杰;;重要外來入侵害蟲西花薊馬在吉林省部分地區(qū)的首次發(fā)現(xiàn)[J];北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報;2015年02期

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1 陳銳芬;西花薊馬對寄主植物的適應(yīng)特性研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2011年

本文編號：2711656