【摘要】：朱砂葉螨(Tetranychus cinnabarinus)是一種可危害多種農(nóng)作物的重要農(nóng)業(yè)害螨,由于葉螨的自身特點以及化學(xué)藥劑的大量使用,其抗藥性問題日趨嚴重。丁氟螨酯是一種新型的苯甲酰乙腈類殺螨劑,于2007年首先在日本登記。目前已在十五個國家廣泛使用,而葉螨對丁氟螨酯產(chǎn)生抗藥性已多有報道。MicroRNA(miRNA)作為調(diào)控基因表達的重要因子,在害蟲的研究中發(fā)現(xiàn)其可通過調(diào)控抗藥性基因的表達,進而影響害蟲抗藥性的形成。在昆蟲中,miR-1是一個相對保守且表達豐度較高的miRNA,主要調(diào)控昆蟲的生長發(fā)育及免疫應(yīng)答過程,迄今尚未發(fā)現(xiàn)其調(diào)控害蟲(螨)抗藥性的報道。本論文鑒定了朱砂葉螨miR-1(Tci-miR-1-3p)調(diào)控的抗性相關(guān)靶標(biāo)基因,明確靶標(biāo)基因在朱砂葉螨丁氟螨酯抗性形成中的功能,進而闡明了Tci-miR-1-3p在朱砂葉螨丁氟螨酯抗性形成中的作用,主要研究結(jié)果如下:1.Tci-miR-1-3p在敏感、抗性品系中差異表達分析采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測Tci-miR-1-3p在丁氟螨酯敏感品系(SS)和抗性品系(CYR)中表達量,發(fā)現(xiàn)Tci-miR-1-3p在CYR中的表達量較SS顯著降低,暗示其與朱砂葉螨丁氟螨酯抗性的形成有關(guān)。2.Tci-miR-1-3p靶標(biāo)基因的篩選及驗證為了明確Tci-miR-1-3p調(diào)控抗藥性的深層機制,采用miRanda和RNAhybrid等六種miRNA靶標(biāo)預(yù)測軟件篩選Tci-miR-1-3p的靶標(biāo)基因,共獲得谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(TCGSTM4)、EF-hand蛋白(EFHAND2)、細胞色素P450(CYP307A1)和羧酸酯酶(TCCarE 14)等19條候選基因。進一步采用飼喂法驗證Tci-miR-1-3p與候選基因的靶向關(guān)系,結(jié)果表明,取食Tci-miR-1-3p模擬物(Tci-miR-1-3p mimic)后,朱砂葉螨體內(nèi)Tci-miR-1-3p的含量較對照顯著增加,同時候選靶標(biāo)基因中僅TCGSTM4和EFHAND2分別降低至0.57和0.55倍,由此表明候選靶標(biāo)基因中TCGSTM4和EFHAND2可能受到Tci-miR-1-3p的反向調(diào)控。綜合有關(guān)基因功能的文獻報道,選擇與螨類抗藥性關(guān)系更密切的TCGSTM4作為靶標(biāo)基因進行下一步的靶向關(guān)系研究。雙熒光素酶報告系統(tǒng)進一步明確了Tci-miR-1-3p與TCGSTM4的靶向關(guān)系:當(dāng)Tci-miR-1-3p模擬物與TCGSTM4的3’非編碼區(qū)(3’UTR)雙熒光素酶報告基因載體(pmirGLO-UTR)轉(zhuǎn)染人腎上皮細胞系(HEK293T)細胞后,熒光活性顯著降為對照組(陰性對照模擬物與pmirGLO-UTR共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞)的50%;而將Tci-miR-1-3p模擬物與突變的3’UTR雙熒光素酶報告基因載體(pmirGLO-MUTR)轉(zhuǎn)染HEK293T細胞后,熒光活性則和對照組沒有顯著差異。以上結(jié)果說明Tci-miR-1-3p能夠與TCGSTM4相應(yīng)的非編碼區(qū)結(jié)合而調(diào)控TCGSTM4的表達,也就是說Tci-miR-1-3p對TCGSTM4存在靶向調(diào)控關(guān)系。3.Tci-miR-1-3p對TCGSTM4的表達以及對朱砂葉螨藥劑敏感性的影響分別飼喂Tci-miR-1-3p模擬物和抑制劑(Tci-miR-1-3p inhibitor)來提高和降低朱砂葉螨體內(nèi)Tci-miR-1-3p的含量,然后檢測TCGSTM4表達量隨Tci-miR-1-3p含量改變而變化的情況以及朱砂葉螨對丁氟螨酯敏感性的變化。飼喂模擬物后,Tci-miR-1-3p在SS和CYR體內(nèi)分別上調(diào)1.51和2.93倍,TCGSTM4表達水平相應(yīng)降低至0.57和0.72倍,TCGSTM4蛋白表達水平也分別降低至0.47和0.61倍。相反,飼喂抑制劑后,Tci-miR-1-3p在SS和CYR體內(nèi)分別降低至0.69和0.52倍,TCGSTM4表達水平相應(yīng)顯著上調(diào)1.29和1.32倍,TCGSTM4蛋白表達水平也分別上調(diào)1.96和2.11倍。此外,朱砂葉螨敏感及抗性品系在飼喂Tci-miR-1-3p模擬物后,丁氟螨酯LC_(10)和LC_(30)濃度下的死亡率顯著升高,其中敏感品系升高了14.01%和14.86%,抗性品系升高了16.69%和20.07%;而在飼喂Tci-miR-1-3p抑制劑后,LC_(30)和LC_(50)濃度下的死亡率均顯著降低,其中敏感品系降低了12.12%和12.15%,抗性品系降低了14.37%和24.13%。通過飼喂模擬物和抑制劑,人為提高和降低朱砂葉螨體內(nèi)Tci-miR-1-3p含量的方式進一步證實Tci-miR-1-3p能夠反向調(diào)控TCGSTM4的表達,進而影響到朱砂葉螨對丁氟螨酯的敏感性。4.TCGSTM4的RNA干擾及其響應(yīng)藥劑脅迫研究為了明確TCGSTM4是否參與了朱砂葉螨丁氟螨酯抗藥性的形成,本研究通過RNA干擾(RNAi)技術(shù)對TCGSTM4進行功能研究。結(jié)果顯示:飼喂TCGSTM4 dsRNA后,TCGSTM4的表達在SS和CYR中分別降低至0.41倍和0.49倍。與對照組相比,SS和CYR在飼喂TCGSTM4 dsRNA 48 h后,使用LC_(10)和LC_(30)濃度處理后的死亡率均顯著升高,其中敏感品系升高了11.69%和15.69%,抗性品系升高了16.72%和19.19%。另外,經(jīng)丁氟螨酯亞致死劑量(LC_(10))誘導(dǎo)后,TCGSTM4表達量在CYR中顯著上調(diào)(誘導(dǎo)12h和24h后),而敏感品系誘導(dǎo)前后TCGSTM4的表達量沒有顯著變化。RNAi和藥劑脅迫實驗結(jié)果表明TCGSTM4在丁氟螨酯的抗性形成中具有重要作用。5.TCGSTM4的原核表達及其藥劑代謝研究借助E.coli系統(tǒng),將朱砂葉螨TCGSTM4進行基因異源表達,獲得了26 kDa大小的可溶蛋白。利用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶特異底物1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)對純化的重組蛋白進行活性測定,發(fā)現(xiàn)其具有CDNB催化活性(比活力值為428.90±12.98 nmol/mg pro.min~(-1))。同時該蛋白的催化活性可被丁氟螨酯和丁氟螨酯在螨體內(nèi)的活化物質(zhì)(AB-1)所抑制,抑制中濃度值分別為0.83±0.08 mM和0.18±0.05 mM。進一步的藥劑代謝實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)TCGSTM4重組蛋白能夠直接降解丁氟螨酯,并且隨著重組蛋白用量增加,丁氟螨酯的降解率也逐漸升高:當(dāng)TCGSTM4重組蛋白添加量為20.0μg、40.0μg和60.0μg時,丁氟螨酯的降解率分別為32.21%±2.44%,36.00%±5.83%和41.79%±1.69%�；虍愒幢磉_及其與殺螨劑互作的研究結(jié)果證明TCGSTM4的編碼產(chǎn)物是GST酶蛋白,且能夠有效分解丁氟螨酯。
【圖文】：

圖 1.1 miRNA 的形成過程自 http://www.bio1000.com/zt/experiment/molecular/503841.html）Fig 1.1 The formation process of miRNAted from http://www.bio1000.com/zt/experiment/molecular/503841.htm是一類轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控因子，它主要作用于目的基因轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)目的基因的表達。MiRNA 作用的方式一般有兩種：一種式導(dǎo)致翻譯的抑制，另一種是以完全或近乎完全互補的被降解[53]。MiRNA 與目標(biāo) mRNA 的結(jié)合位點一般位于目標(biāo) 研究發(fā)現(xiàn)在目標(biāo) mRNA 的開放閱讀框和 5’UTR 也存在 miR�；パa結(jié)合位點位于 3’UTR 的概率要比位于開放閱讀框的概的概率又要比位于 5’UTR 的概率大。，大多數(shù) miRNA 通過和目標(biāo) mRNA 完全配對從而降解 m般 miRNA 是通過抑制目的 mRNA 的翻譯來達到調(diào)控作用[56明動物的 miRNA 能夠通過降解 mRNA 來降低 mRNA 的

第二章 Tci-miR-1-3p 的差異表達檢測及抗性相關(guān)靶標(biāo)篩選）挑取 3-5 日齡雌成螨置于 2.0 mL 的離心管中，進行饑餓處理 2）將豇豆葉片剪成邊長為 1.5cm 大小，，然后置于 60 ℃烘干 3-5mRNAmimic 溶液中（10mM）3-5h，待試劑被充分吸收，以 DEPC照，另設(shè) Negative mimic 作為陰性對照（圖 2.1）；）挑取饑餓處理 24 h 的雌成螨在豇豆葉片上，取食 48 h；）最后挑取飼喂 48 h 后的雌成螨進行接下來的試驗。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S433.7

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本文編號：2711725