【摘要】：馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)可侵染包括馬鈴薯(Solanumtuberosum L.)和煙草(Nicotiana tabacum L.)在內(nèi)眾多茄科作物。由于其分布廣泛和寄主眾多給世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失。PVY株系類型眾多且其基因組在自然進化中十分容易發(fā)生變異是對其難以防治的重要原因之一。本研究通過近三年到山東省馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)和貴州省煙區(qū),實地考察采集疑似病毒病樣品。分別用血清學(xué)方法、生物學(xué)方法和分子生物學(xué)并利用生物信息學(xué)手段對獲得的數(shù)據(jù)進行綜合分析,旨在明確危害兩地區(qū)PVY的株系類型。主要結(jié)果如下:1、山東省馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)PVY株系鑒定。2015~2017年間從山東省不同馬鈴薯種植區(qū)獲取了584份大田樣品和109份種薯樣品。血清學(xué)結(jié)果顯示,515份大田馬鈴薯樣品和24份種薯樣品為PVY陽性;生物學(xué)結(jié)果顯示接種133個PVY陽性樣品,在普通煙上全部引起葉脈壞死和花葉癥狀;分子生物學(xué)利用RT-PCR方法擴增得到56個PVY分離物5’端和3’端基因組和7個PVY分離物全基因組序列。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)51個PVY分離物中在P1處均含有重組位點,系統(tǒng)進化樹顯示51個PVY分離物HCpro基因與N株系親緣關(guān)系最近,50個PVY分離物中CP基因與O株系聚集為一組,僅CN:XT27:16分離物CP與N株系聚集為一組。綜上,山東省馬鈴薯種植區(qū)中PVY株系類型為PVY~N株系,其中PVY~(NTN-NW)(SYR-II型)為優(yōu)勢種群株系。2、貴州省煙區(qū)PVY株系類型鑒定。2016~2017年從貴州省各地區(qū)共獲得45份疑似病毒病樣品。血清學(xué)結(jié)果顯示PVY總檢出率為60%;選取14個PVY陽性樣品接種普通煙觀察表型發(fā)現(xiàn),除CN:GZ5:17樣品僅引起普通煙花葉外,其余13個樣品均可在普通煙上引起葉脈壞死和花葉癥狀;分子生物學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)14個樣品均擴增出PVY目的條帶;通過針對P1、HCpro和CP基因序列分析發(fā)現(xiàn)11個PVY分離物在P1位置存在重組信號,CN:GZ8:16、CN:GZ22:16和CN:GZ5:17三個基因均沒有檢測到重組位點。系統(tǒng)進化樹顯示除CN:GZ5:17分離物HCpro和CP均聚集為O組外,其余13個分離物HCpro均聚集到N組,CP聚集到O組。通過分析5個PVY全基因組發(fā)現(xiàn),2個分離物基因組中含有3個重組信號,另外3個含有4個重組信號,且重組位點與PVY~(NTN-NW)(SYR-I型和SYR-II型)一致。3、不同地理起源和不同寄主PVY分離物基因組無明顯差異。序列分析來自兩個地區(qū)的PVY分離物基因組,發(fā)現(xiàn)兩地的PVY優(yōu)勢種群PVY~(NTN-NW)株系CP中均包含單克隆抗體MAb1128可識別的RPEQGSIQSNP抗原決定簇,基于兩地PVY分離物HCpro基因和CP基因構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,分析發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的分離物HCpro基因和CP基因各自在親緣關(guān)系上均不存在明顯差異。
【圖文】：

2017 棗莊 滕州 98 14 14.29聊城 陽谷 11 10 90.91總數(shù) 109 24 22.023.1.2 大多數(shù) PVY 分離物可引起煙草葉脈壞死癥狀PVY 分離物能否在煙草上引起葉脈壞死癥狀是鑒定 PVY 株系的重要依據(jù)。本課題從 2015 年和 2016 年 PVY 陽性樣品中，從不同地區(qū)按照總數(shù)20%~40%的比例選取了 133 個樣品。通過摩擦接種方法將選取的樣品接種到 4周左右的普通煙 NC89。以緩沖液為陰性對照，以 PVYN605 作為陽性對照。第5 天后，接種煙草系統(tǒng)葉片開始出現(xiàn)脈明癥狀，接種 14 天后所有分離物都能夠在普通煙上引起葉脈壞死癥狀（圖 1，附表 3）。該結(jié)果表明所有接種的 133 份PVY 分離物生物學(xué)特征與 PVYN株系相一致。

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文Y37F/PVY2532R 和 PVY8506F/PVY9701R 引物對分別 RT-PCR 擴增 PVY 基組中 5·末端（P1/HCpro）和 3·末端（CP/3·UTR）序列。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1.0 %瓊糖凝膠電泳分析。結(jié)果表明在 2.5kb 左右和 1.1kb 左右具有特異性的目的條帶圖 2）。將目的條帶通過凝膠回收試劑盒純化后送華大基因測序。測序結(jié)果 DNAstar 軟件包中 Seqman 軟件拼接。經(jīng) Blast 在線比對，，結(jié)果表明擴增到的段為 PVY 序列。獲得的 51 個分離物的 P1/HCpro 和 CP 序列上傳到 GenBank據(jù)庫（登錄號見附表 3）。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S432.41

【參考文獻】

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本文編號：2699497