【摘要】：楊樹黑斑病是楊樹的主要病害之一。在我國,其最主要的病原菌為楊生褐盤二孢菌(Marssonina brunnea),該菌能夠侵染青楊派、黑楊派、白楊派的很多種類和品種,對楊樹人工林的危害尤為嚴(yán)重。楊生褐盤二孢菌有兩個專化型,即單芽管�；�(M.brunnea f.sp.monogermtubi)和多芽管專化型(M brunnea f.sp.multigermtubi)。在自然條件下,它們分別侵染不同派系的楊樹寄主,非親和派系楊樹對專化型具有穩(wěn)定的抗病性,因此成為楊樹抗病育種研究的重要體系。然而,目前有關(guān)兩個專化型的詳細(xì)侵染過程和寄生特性等尚不明確,這直接阻礙了研究工作的深入開展。同時,效應(yīng)分子作為病原菌的關(guān)鍵致病因子,是抗病寄主識別病原菌的重要靶標(biāo),揭示效應(yīng)分子的生物學(xué)功能是研究病害互作機(jī)制的重要內(nèi)容。因此,本論文應(yīng)用微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù),進(jìn)一步明確了兩個專化型的區(qū)別;采用多種顯微技術(shù)詳細(xì)觀察了楊生褐盤二孢菌的附著、定殖和擴(kuò)展等侵入過程;運用mRNA-Seq技術(shù)對兩個�；团c親和寄主互作過程中基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行分析;采用瞬時表達(dá)和酵母雙雜等技術(shù)對專性效應(yīng)分子做了研究,旨在明確楊生褐盤二孢菌的侵染、寄生特性,了解兩個專化型與寄主楊樹的互作機(jī)制,為抗病育種工作提供有價值的信息。主要研究結(jié)果及結(jié)論如下:1.開發(fā)了楊生褐盤二孢菌的微衛(wèi)星分子標(biāo)記,明確了兩個專化型在遺傳結(jié)構(gòu)上的區(qū)別。通過分析楊生褐盤二孢菌的基因組發(fā)現(xiàn)該菌含有豐富的微衛(wèi)星位點,繼而經(jīng)過引物設(shè)計和篩選獲得了 24對微衛(wèi)星引物并證實它們能夠用于楊生褐盤二孢菌遺傳多樣性的研究。使用這些引物研究該菌的遺傳多樣性發(fā)現(xiàn):兩個�；腿后w遺傳結(jié)構(gòu)的差異明顯;同時,單芽管�；捅榷嘌抗軐；途哂懈S富的遺傳多樣性。研究結(jié)果進(jìn)一步證實兩個�；偷目陀^存在,并說明多芽管�；涂赡苡蓡窝抗軐；瓦M(jìn)化而來。2.揭示了楊生褐盤二孢菌對楊樹的組織病理侵入過程,闡明了其半活養(yǎng)的寄生特性。楊生褐盤二孢菌在寄主葉片表面形成侵染芽管,可直接從角質(zhì)層侵入寄主。在侵染前期,該病菌主要以侵染泡囊和初生菌絲進(jìn)行擴(kuò)展,這些結(jié)構(gòu)可突破寄主細(xì)胞壁,但不能穿過細(xì)胞膜,寄主細(xì)胞不發(fā)生死亡。在侵染后4 d,細(xì)長的次生菌絲大量出現(xiàn),很多寄主細(xì)胞已經(jīng)死亡,這些結(jié)果表明該菌是半活養(yǎng)型病原真菌,其寄生過程包含活養(yǎng)和死養(yǎng)兩個階段。此外,通過對侵染結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)特征的觀察發(fā)現(xiàn),侵染芽管、侵染泡囊和次生菌絲等結(jié)構(gòu)與寄主發(fā)生了明顯的相互作用。3.發(fā)現(xiàn)兩個派系楊樹品種對楊生褐盤二孢菌侵染具有不同的響應(yīng)方式。在楊樹黑斑病的發(fā)生過程中,黑楊派和白楊派寄主分別有3301和4382個基因發(fā)生差異表達(dá),這些基因涉及寄主的抗病蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、初生代謝和次生代謝等過程。維恩圖分析和基因共表達(dá)趨勢分析等表明,兩個派系楊樹品種在響應(yīng)黑斑病菌侵染時表現(xiàn)出較大差異。黑楊派楊樹在侵染初期(接種后6 h)有1543個基因發(fā)生上調(diào)表達(dá),包括與細(xì)胞壁代謝、植物激素信號通路等生物過程相關(guān)的很多基因,說明其發(fā)生了較強(qiáng)的防御反應(yīng)。與之不同,白楊派寄主在侵染初期反應(yīng)較弱,只有526個基因發(fā)生上調(diào)表達(dá);但在侵染后96 h該寄主響應(yīng)強(qiáng)烈,有4093個基因發(fā)生了差異表達(dá),其中有1773個基因發(fā)生下調(diào)表達(dá),包括碳水化合物代謝、光合作用等生物過程相關(guān)的很多基因。此外,兩個�；涂赡芡ㄟ^影響親和寄主不同生理過程完成寄生方式的轉(zhuǎn)變。黑楊派寄主的類黃酮合成通路和苯丙素合成通路可能參與了多芽管�；图纳绞降霓D(zhuǎn)變;而單芽管專化型可能通過引發(fā)白楊派寄主的過敏性細(xì)胞死亡實現(xiàn)寄生方式的轉(zhuǎn)變。4.篩選到多芽管專化型的4個潛在專性效應(yīng)分子。通過比對分析和軟件預(yù)測獲得156個楊生褐盤二孢菌的效應(yīng)分子。其中,多芽管�；途昕赡芫哂�4個專性效應(yīng)分子,分別為 MBM_02130、MBM_03364、MBM_02980 和 MBM_06785,它們在多芽管專化型的侵染過程中均發(fā)生顯著上調(diào)表達(dá);同時,這4個效應(yīng)分子的表達(dá)均不能引發(fā)煙草的免疫反應(yīng),屬于毒性效應(yīng)分子。其中,MBM_02980和MBM_06785在死養(yǎng)階段的表達(dá)量顯著提高,說明它們可能在多芽管專化型殺死寄主組織的過程中起著重要的作用。此外,酵母雙雜交試驗結(jié)果表明MBM_06785可以同楊樹的類S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因發(fā)生互作。
【圖文】：

ＬＯＳＩＴＩＡＮ分析結(jié)果表明，２４對引物中有２３對引物位于中性區(qū)域，說明這２３逡逑對引物能夠提供更可靠的遺傳多樣性信息，可以用于后續(xù)研究。其中，只有引物逡逑ＭＢＳ７３位于異常區(qū)域，在研究中應(yīng)該選擇性地進(jìn)行使用（圖２．４）。逡逑Ｆｓｔ／Ｈｅ逡逑ＭＢＳ７３．逡逑０邋１Ｖ邐：逡逑°＂＾ＢｒＴ逡逑００；邋＿Ｆ＾逡逑０邋００邋丨邐？邋？邋？邋？逡逑－００５：，＂邋＂ｒ／＂？邐，邐：邐：逡逑－ｏ邋ｉｏ邐．．趣二邋一；二：＿人逡逑０邋００邐０邋０５邐０１０邐０１５邐０邋２０邐０邋２５邐０邋３０邐０邋３５邐０邋４０邐０邋４５邐０邋５０邐０邋５５邐０邋６０邐０邋６５邐０邋７０邐０邋７５邐０邋８０邐０邋８５邐０邋９０逡逑Ｈｅ逡逑［？邋Ｍａｒｋｅｒｓ邋Ｃａｎｃｈｄａｔｅ邋ｂａｔａｎｃｎｇ邋ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ邋ＣａｎｔＭａｔｅ邋ｎｅｕｔｒａｌ邋—邋ＣａｒｘＸＭｅ邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ｜逡逑圖２．４所^u發(fā)楊生褐盤二孢菌微衛(wèi)星引物的ＬＯＳ１ＴＡＮ分析結(jié)果逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．４邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＬＯＳＩＴＡＮ邋ａｎａｌｙｓｅｓ邋ａｂｏｕｔ邋ｔｈｅ邋ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ邋ｐｒｉｍｅｒｓ邋ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ邋ｆｏｒ邋Ｍ邋ｂｒｕｎｎｅａ逡逑２．２．３楊生褐盤二孢菌微衛(wèi)星引物的驗證逡逑使用ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ分析預(yù)測北京和河南群體的遺傳結(jié)構(gòu)，將結(jié)果數(shù)據(jù)導(dǎo)入逡逑ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ邋ＨＡＲＶＥＳＴＥＲ進(jìn)行最佳Ｋ值的評估分析。結(jié)果表明，，Ｋ值為２時ＤｅｌｔａＫ逡逑值最高，說明北京河南的４７個種菌株應(yīng)該被劃分為兩個群體，這與菌株的采集背景逡逑相符

群體遺傳結(jié)構(gòu)圖表明，北京和河南兩個群體之間的遺傳結(jié)構(gòu)差異明顯，同一群體逡逑菌株的遺傳結(jié)構(gòu)基本相同，只有６個個體的遺傳結(jié)構(gòu)與同地理群體的個體存在較大的逡逑差異（北京群體４個，河南群體２個）（圖２．６）。這些結(jié)果證明２４對引物可以為該菌逡逑的遺傳多樣性提供較準(zhǔn)確的信息，說明引物適用于楊生褐盤二孢菌遺傳多樣性研究。逡逑Ｂ．Ｊ邐ＨＮ逡逑圖２．６北京和河南群體的遺傳結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．６邋Ｔｈｅ邋ｇｅｎｅｔｉｃ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ邋ｆｒｏｍ邋Ｂｅｉｊｉｎｇ邋ａｎｄ邋Ｈｅｎａｎ逡逑依據(jù)菌株個體間的遺傳距離進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，４７個菌株共形成３個類群。其逡逑中，遺傳距離較遠(yuǎn)的類群（紅色方框標(biāo)注）包含９個個體，其中有８個來自北京群體，逡逑只有１個來自河南群體。遺傳距離較近的類群（藍(lán)色方框標(biāo)注）由１６個個體組成，逡逑包括１３個河南個體、３個北京個體；遺傳距離居中的類群（橙色方框標(biāo)注）包含２２逡逑個個體，由１０個河南個體和１２個北京個體組成（圖２．７）�？梢�，北京個體間的遺傳逡逑距離相對較遠(yuǎn)，具有更豐富的遺傳多樣性；而河南個體間的遺傳距離相對比較近，個逡逑體間差異較小，遺傳多樣性較低。（圖２．７）逡逑榻
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S763.7


本文編號：2697594