【摘要】：水稻條紋葉枯病是亞熱帶地區(qū)危害最嚴(yán)重的水稻病害之一。水稻條紋葉枯病是由屬于纖細(xì)病毒屬(Tenuivirus)的水稻條紋病毒(Rice stripe virus,RSV)侵染水稻引起的。RSV主要是由灰飛虱(Small brown planthopper,SBPH)以持久增殖的方式傳播。研究表明RSV編碼的核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein,NP)在病毒傳播方面起著十分重要的作用,因此篩選并研究與RSV NP互作的介體蛋白質(zhì)對(duì)于揭示灰飛虱傳播RSV的機(jī)制是必不可少的。本論文選擇了一個(gè)可能在RSV侵染灰飛虱中腸上皮細(xì)胞時(shí)發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)即糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白6(sugar transporter of Laodelphax striatellus,LsST6)進(jìn)行研究。通過(guò)跨膜區(qū)在線預(yù)測(cè)軟件分析發(fā)現(xiàn)其含有12個(gè)跨膜區(qū),并且在TM2和TM3之間存在一個(gè)保守的GRK結(jié)構(gòu)域,因此推測(cè)LsST6屬于主要促糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證RSV能夠與LsST6互作,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了RSV NP與LsST6存在互作關(guān)系。利用草地貪夜蛾細(xì)胞系進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn),LsST6主要定位在細(xì)胞膜上,而RSV NP定位在細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)在Sf9 Cell中共表達(dá)時(shí),RSV NP卻定位于細(xì)胞膜上,并且與LsST6共定位。這表明LsST6能夠改變這RSV NP在細(xì)胞中的定位。RT-qPCR發(fā)現(xiàn)LsST6在灰飛虱的腸道中大量表達(dá)。利用制備的LsST6單克隆抗體進(jìn)行腸道定位發(fā)現(xiàn),LsST6定位在中腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中。將無(wú)毒灰飛虱飼毒處理后經(jīng)免疫熒光標(biāo)記發(fā)現(xiàn)RSV在第二天開始侵染灰飛虱腸道并且能夠與LsST6共定位于上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上;第四天和第八天時(shí)兩者仍有共定位在上皮細(xì)胞膜上的情況。因此推測(cè)LsST6可能在RSV侵染中腸上皮細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步確定LsST6的功能,將提純的RSV病毒粒子加入到培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)該細(xì)胞系表達(dá)外源的LsST6時(shí),RSV病毒粒子可以進(jìn)入到該細(xì)胞中,而不能進(jìn)入未表達(dá)LsST6的細(xì)胞中。Northern-blot結(jié)果顯示隨著RSV病毒粒子加入Sf9細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng),RSV在RNA水平上的量是持續(xù)增加的。RT-qPCR結(jié)果同樣顯示在RSV病毒粒子加入到Sf9細(xì)胞后,隨著時(shí)間的增加RSV在RNA水平的含量不斷增加。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LsST6是RSV能夠成功侵染Sf9細(xì)胞的一個(gè)重要因子。通過(guò)顯微注射dsRNA確定是否能夠有效干擾LsST6在無(wú)毒灰飛虱體內(nèi)的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射dsLsST6的灰飛虱與注射dsGFP的對(duì)照組相比,LsST6在RNA水平上的表達(dá)顯著降低并且抑制效果可以持續(xù)12天以上。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)注射dsLsST6后無(wú)毒灰飛虱獲取以及傳播RSV的能力顯著的降低,但是帶毒灰飛虱體內(nèi)RSV含量以及傳毒率卻沒有明顯的變化。以上結(jié)果充分表明LsST6作為一個(gè)關(guān)鍵因子參與了RSV侵染灰飛虱中腸上皮細(xì)胞的過(guò)程,但是不會(huì)影響RSV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。
【圖文】：

1圖 1.1 RSV 在水稻上的癥狀及危害（A：RSV 侵染癥狀；B：RSD 田間發(fā)生狀況）g. 1.1 Symptom and damage of RSV in rice (A: Symptom of RSV infection in rice leaf, B: Occurrence of RSD infield)著近年來(lái)對(duì)水稻條紋葉枯病進(jìn)行有針對(duì)性的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)，防控昆蟲傳毒介體數(shù)量以及抗病新選育以及推廣，，水稻條紋葉枯病在全國(guó)的發(fā)生面積以及危害程度都有顯著的下降。但是研

圖 1.2 RSV 的基因組結(jié)構(gòu)圖Fig. 1.2 Genome structure of RSV表 1.1 RSV 的基因組及編碼蛋白的功能Table.1.1Genome and protein functions of RSV的傳播介體及循回路徑
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S435.111.4

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