發(fā)布時(shí)間：2020-06-04 08:12

【摘要】：水稻病毒病是對(duì)水稻生產(chǎn)危害最嚴(yán)重的病害之一,嚴(yán)重影響了水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。其中,水稻黑條矮縮病毒(Rice black streaked dwarf virus,RBSDV)和水稻條紋病毒(Rice stripe virus,RSV)是對(duì)水稻危害最為嚴(yán)重的兩種病毒,兩者均通過(guò)灰飛虱(Laodelphax striatellus)傳播。植物病毒與介體昆蟲(chóng)之間相互作用的研究是分析介體傳毒機(jī)制,控制病毒傳播的主要手段。RBSDV的非結(jié)構(gòu)蛋白P9-1在病毒侵染過(guò)程中形成病毒原質(zhì)結(jié)構(gòu)(毒質(zhì),viroplasm),可能對(duì)病毒的復(fù)制和侵染具有非常重要的作用。本研究以灰飛虱和水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)為實(shí)驗(yàn)材料,以RBSDV的P9-1為誘餌蛋白篩選灰飛虱的cD NA文庫(kù),并對(duì)篩選到的可能參與介體傳毒的26S蛋白蛋白酶體亞基Rpn8進(jìn)行功能驗(yàn)證,對(duì)Rpn8發(fā)揮作用的分子機(jī)理進(jìn)行初步分析。主要結(jié)果及結(jié)論如下:(1)P9-1定位于細(xì)胞質(zhì)。通過(guò)亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)P9-1定位于細(xì)胞質(zhì),且呈毒質(zhì)形式存在。(2)RBSDV的病毒蛋白P9-1與灰飛虱26S蛋白酶體亞基Rpn8互作。病毒與介體昆蟲(chóng)蛋白的互作研究是了解介體傳毒機(jī)制的主要方法,因此,我們以P9-1為誘餌蛋白釣取灰飛虱的cD NA文庫(kù),并獲得了包括Rpn8在內(nèi)的11個(gè)可能與P9-1互作的蛋白。有研究表明,26S蛋白酶體參與調(diào)控病毒在介體灰飛虱中的傳播,而Rpn8是26S蛋白酶體的一個(gè)亞基,所以,我們以Rpn8為主要研究對(duì)象,并通過(guò)免疫共沉淀(Co-IP)以及雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)實(shí)驗(yàn)證明了Rpn8確實(shí)與P9-1互作。(3)Rpn8負(fù)調(diào)控灰飛虱中RBSDV的積累。為檢測(cè)Rpn8是否參與調(diào)控病毒傳播,體外合成ds Rpn8并飼喂帶毒灰飛虱以下調(diào)Rpn8的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)灰飛虱體內(nèi)RBSDV的外殼蛋白編碼基因CP的表達(dá)水平升高,說(shuō)明灰飛虱體內(nèi)的病毒積累量增加。將Rpn8 RNAi轉(zhuǎn)基因水稻接種帶RBSDV的灰飛虱,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻的感病率高于野生型。表明Rpn8下調(diào)表達(dá)有利于灰飛虱中RBSDV的積累與傳播。(4)RBSDV抑制灰飛虱26S蛋白酶體功能。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明帶RBSDV的灰飛虱中Rpn8的表達(dá)量顯著低于無(wú)毒灰飛虱;Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示帶毒灰飛虱中泛素化蛋白積累量高于無(wú)毒灰飛虱,說(shuō)明RBSDV可能通過(guò)降低Rpn8的表達(dá)從而影響灰飛虱26S蛋白酶體的功能。(5)灰飛虱26S蛋白酶體亞基Rpn8與Rpn7互作。酵母雙雜交(Y2H)實(shí)驗(yàn)、熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(LCI)以及體外免疫共沉淀(pull-down)實(shí)驗(yàn)表明Rpn8與灰飛虱中26S蛋白酶體另一個(gè)亞基Rpn7互作,且P9-1與Rpn7不互作。(6)Rpn8亦與RSV的P2蛋白互作。qRT-PCR結(jié)果顯示,帶RSV的灰飛虱中Rpn8的表達(dá)量亦低于無(wú)毒灰飛虱,說(shuō)明RSV可能通過(guò)降低Rpn8的表達(dá)調(diào)控26S蛋白酶體功能。Rpn8的下調(diào)促進(jìn)灰飛虱中RSV的積累并且Rpn8 RNAi轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)RSV的感病率增加,說(shuō)明Rpn8負(fù)調(diào)控灰飛虱中RSV的積累與傳播。之后我們通過(guò)Y2H實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Rpn8與RSV的P2蛋白互作,LCI和Co-IP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明兩者互作。以上結(jié)果表明RSV通過(guò)干擾灰飛虱26S蛋白酶體功能促進(jìn)病毒積累的作用機(jī)制與RBSDV相類似。綜上所述,RBSDV可能通過(guò)降低Rpn8的表達(dá)從而調(diào)控灰飛虱26S蛋白酶體功能,促進(jìn)病毒在灰飛虱中的積累。已知26S蛋白酶體各組分間的互作決定其功能發(fā)揮,而本研究證明灰飛虱中Rpn8與Rpn7互作、病毒蛋白P9-1與Rpn8互作,而P9-1與Rpn7不互作。因此我們推測(cè)RBSDV還可能通過(guò)P9-1影響Rpn8與Rpn7的互作抑制灰飛虱26S蛋白酶體功能,從而促進(jìn)其在灰飛虱體內(nèi)的積累,具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
【圖文】：

物質(zhì)進(jìn)入水解腔是由 α 環(huán)控制的，它只允許未折疊的；19S 調(diào)節(jié)粒子（RP）可以進(jìn)一步分解成兩個(gè)亞復(fù)合物，（Base），另一個(gè)是外部的蓋子復(fù)合物（Lid）（Glickman ase（ATPases 與多種細(xì)胞活性相關(guān)）亞基：Rpt1-Rpt6 和 4n2、Rpn10 和 Rpn13 組成�；字械� ATPases 是底物蛋白S 水解腔中所必須的（Braun et al., 1999；Rubin et al., 1998ase 亞基組成：Rpn3、Rpn5-Rpn9、Rpn11、Rpn12 和 Sem對(duì)底物的去泛素化（Verma et al., 2002；Yao and Cohen, 20004）。Rpn10 是能和其他蛋白酶體可逆結(jié)合的泛素受體蛋白化的蛋白傳遞到蛋白酶體中（Elsasser and Finley, 2005）。蛋白水解作用并且介導(dǎo)泛素標(biāo)簽的識(shí)別和回收利用以及去 CP 中進(jìn)行水解（Ravid and Hochstrasser, 2008；Finley, 200

果與分析P9-1 是 RBSDV 的弱沉默抑制子有研究表明，P9-1 在 RBSDV 侵入動(dòng)植物細(xì)胞后形成毒質(zhì)的過(guò)程中發(fā)揮重要 P9-1 可能是 RBSDV 的弱沉默抑制子（Zhang et al., 2008）。因此，我們構(gòu)建了9-1 融合表達(dá)載體 35S::P9-1-GFP，以強(qiáng)沉默抑制子 P19 與 GFP 的融合表達(dá):P19-GFP 作為陽(yáng)性對(duì)照，瞬時(shí)表達(dá)載體 35S::GFP 為陰性對(duì)照。利用農(nóng)桿菌介染本生煙，3d 后在紫外燈下觀察 GFP 熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)超表達(dá) P9-1 后，GFP 的低于超表達(dá) P19 后的熒光強(qiáng)度但明顯高于陰性對(duì)照（圖 3-1A）。將上述本生煙取材，分別提取總 RNA 和 sRNA，利用 Northern blot 分別檢測(cè)三組樣品中 GA 和 siRNA 的積累量，結(jié)果顯示瞬時(shí)超表達(dá) P9-1 后 GFP siRNA 的積累量明白對(duì)照但高于陽(yáng)性對(duì)照（圖 3-1B），，說(shuō)明 P9-1 能夠抑制 siRNA 積累，降低沉
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S435.111.4

【參考文獻(xiàn)】

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相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

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本文編號(hào)：2696107