【摘要】：水稻病毒病是對水稻生產(chǎn)危害最嚴(yán)重的病害之一,嚴(yán)重影響了水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。其中,水稻黑條矮縮病毒(Rice black streaked dwarf virus,RBSDV)和水稻條紋病毒(Rice stripe virus,RSV)是對水稻危害最為嚴(yán)重的兩種病毒,兩者均通過灰飛虱(Laodelphax striatellus)傳播。植物病毒與介體昆蟲之間相互作用的研究是分析介體傳毒機制,控制病毒傳播的主要手段。RBSDV的非結(jié)構(gòu)蛋白P9-1在病毒侵染過程中形成病毒原質(zhì)結(jié)構(gòu)(毒質(zhì),viroplasm),可能對病毒的復(fù)制和侵染具有非常重要的作用。本研究以灰飛虱和水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)為實驗材料,以RBSDV的P9-1為誘餌蛋白篩選灰飛虱的cD NA文庫,并對篩選到的可能參與介體傳毒的26S蛋白蛋白酶體亞基Rpn8進行功能驗證,對Rpn8發(fā)揮作用的分子機理進行初步分析。主要結(jié)果及結(jié)論如下:(1)P9-1定位于細胞質(zhì)。通過亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)P9-1定位于細胞質(zhì),且呈毒質(zhì)形式存在。(2)RBSDV的病毒蛋白P9-1與灰飛虱26S蛋白酶體亞基Rpn8互作。病毒與介體昆蟲蛋白的互作研究是了解介體傳毒機制的主要方法,因此,我們以P9-1為誘餌蛋白釣取灰飛虱的cD NA文庫,并獲得了包括Rpn8在內(nèi)的11個可能與P9-1互作的蛋白。有研究表明,26S蛋白酶體參與調(diào)控病毒在介體灰飛虱中的傳播,而Rpn8是26S蛋白酶體的一個亞基,所以,我們以Rpn8為主要研究對象,并通過免疫共沉淀(Co-IP)以及雙分子熒光互補(BiFC)實驗證明了Rpn8確實與P9-1互作。(3)Rpn8負調(diào)控灰飛虱中RBSDV的積累。為檢測Rpn8是否參與調(diào)控病毒傳播,體外合成ds Rpn8并飼喂帶毒灰飛虱以下調(diào)Rpn8的表達。發(fā)現(xiàn)灰飛虱體內(nèi)RBSDV的外殼蛋白編碼基因CP的表達水平升高,說明灰飛虱體內(nèi)的病毒積累量增加。將Rpn8 RNAi轉(zhuǎn)基因水稻接種帶RBSDV的灰飛虱,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻的感病率高于野生型。表明Rpn8下調(diào)表達有利于灰飛虱中RBSDV的積累與傳播。(4)RBSDV抑制灰飛虱26S蛋白酶體功能。qRT-PCR實驗結(jié)果表明帶RBSDV的灰飛虱中Rpn8的表達量顯著低于無毒灰飛虱;Western blot實驗結(jié)果顯示帶毒灰飛虱中泛素化蛋白積累量高于無毒灰飛虱,說明RBSDV可能通過降低Rpn8的表達從而影響灰飛虱26S蛋白酶體的功能。(5)灰飛虱26S蛋白酶體亞基Rpn8與Rpn7互作。酵母雙雜交(Y2H)實驗、熒光素酶互補實驗(LCI)以及體外免疫共沉淀(pull-down)實驗表明Rpn8與灰飛虱中26S蛋白酶體另一個亞基Rpn7互作,且P9-1與Rpn7不互作。(6)Rpn8亦與RSV的P2蛋白互作。qRT-PCR結(jié)果顯示,帶RSV的灰飛虱中Rpn8的表達量亦低于無毒灰飛虱,說明RSV可能通過降低Rpn8的表達調(diào)控26S蛋白酶體功能。Rpn8的下調(diào)促進灰飛虱中RSV的積累并且Rpn8 RNAi轉(zhuǎn)基因水稻對RSV的感病率增加,說明Rpn8負調(diào)控灰飛虱中RSV的積累與傳播。之后我們通過Y2H實驗發(fā)現(xiàn)Rpn8與RSV的P2蛋白互作,LCI和Co-IP實驗進一步證明兩者互作。以上結(jié)果表明RSV通過干擾灰飛虱26S蛋白酶體功能促進病毒積累的作用機制與RBSDV相類似。綜上所述,RBSDV可能通過降低Rpn8的表達從而調(diào)控灰飛虱26S蛋白酶體功能,促進病毒在灰飛虱中的積累。已知26S蛋白酶體各組分間的互作決定其功能發(fā)揮,而本研究證明灰飛虱中Rpn8與Rpn7互作、病毒蛋白P9-1與Rpn8互作,而P9-1與Rpn7不互作。因此我們推測RBSDV還可能通過P9-1影響Rpn8與Rpn7的互作抑制灰飛虱26S蛋白酶體功能,從而促進其在灰飛虱體內(nèi)的積累,具體機制有待進一步研究。
【圖文】：

物質(zhì)進入水解腔是由 α 環(huán)控制的，它只允許未折疊的；19S 調(diào)節(jié)粒子（RP）可以進一步分解成兩個亞復(fù)合物，（Base），另一個是外部的蓋子復(fù)合物（Lid）（Glickman ase（ATPases 與多種細胞活性相關(guān)）亞基：Rpt1-Rpt6 和 4n2、Rpn10 和 Rpn13 組成。基底中的 ATPases 是底物蛋白S 水解腔中所必須的（Braun et al., 1999；Rubin et al., 1998ase 亞基組成：Rpn3、Rpn5-Rpn9、Rpn11、Rpn12 和 Sem對底物的去泛素化（Verma et al., 2002；Yao and Cohen, 20004）。Rpn10 是能和其他蛋白酶體可逆結(jié)合的泛素受體蛋白化的蛋白傳遞到蛋白酶體中（Elsasser and Finley, 2005）。蛋白水解作用并且介導(dǎo)泛素標(biāo)簽的識別和回收利用以及去 CP 中進行水解（Ravid and Hochstrasser, 2008；Finley, 200

果與分析P9-1 是 RBSDV 的弱沉默抑制子有研究表明，P9-1 在 RBSDV 侵入動植物細胞后形成毒質(zhì)的過程中發(fā)揮重要 P9-1 可能是 RBSDV 的弱沉默抑制子（Zhang et al., 2008）。因此，我們構(gòu)建了9-1 融合表達載體 35S::P9-1-GFP，以強沉默抑制子 P19 與 GFP 的融合表達:P19-GFP 作為陽性對照，瞬時表達載體 35S::GFP 為陰性對照。利用農(nóng)桿菌介染本生煙，3d 后在紫外燈下觀察 GFP 熒光強度，發(fā)現(xiàn)超表達 P9-1 后，GFP 的低于超表達 P19 后的熒光強度但明顯高于陰性對照（圖 3-1A）。將上述本生煙取材，分別提取總 RNA 和 sRNA，利用 Northern blot 分別檢測三組樣品中 GA 和 siRNA 的積累量，結(jié)果顯示瞬時超表達 P9-1 后 GFP siRNA 的積累量明白對照但高于陽性對照（圖 3-1B），，說明 P9-1 能夠抑制 siRNA 積累，降低沉
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S435.111.4

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 孫宗濤;魏佳;李俊敏;王旭;沈國新;陳劍平;;與RBSDV外殼蛋白P10互作植物因子的篩選與驗證[J];核農(nóng)學(xué)報;2014年05期

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1 劉文文;與傳播水稻條紋病毒相關(guān)的灰飛虱蛋白質(zhì)鑒定與功能研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

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本文編號：2696107