【摘要】：煙草野火病和煙草角斑病是煙草生產(chǎn)過程中兩種主要的細(xì)菌性病害,侵染煙草后會造成煙草葉片穿孔,變褐,烤后葉片易碎,工業(yè)使用性降低,對于煙農(nóng)的增產(chǎn)增收造成嚴(yán)重的影響。因此,建立一套煙草野火病和角斑病的精準(zhǔn)可視化檢測體系,能夠在煙草葉片中未顯癥之前進(jìn)行檢測和預(yù)警,可為病害的防治提供依據(jù),具有重要的理論和現(xiàn)實意義。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop-mediated Isothermal Amplification,簡稱LAMP),具有檢測速度快、對檢測環(huán)境要求低、特異性高、靈敏性強等優(yōu)點,目前被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué),動植物病害檢測,轉(zhuǎn)基因食品檢測等領(lǐng)域。本試驗將LAMP技術(shù)用于煙草野火病和煙草角斑病的檢測,利用全基因組比對的手段,分別獲得了1組煙草野火病菌和角斑病菌的LAMP特異性檢測引物,在此基礎(chǔ)上,建立和優(yōu)化了兩種病原的LAMP快速檢測方法,并進(jìn)行了田間應(yīng)用,為病害發(fā)生預(yù)報提供了一種新的技術(shù)和手段。主要研究結(jié)果如下:(1)分離與純化了煙草野火病菌和煙草角斑病菌。分別對來自于不同地區(qū)的煙草病葉標(biāo)本進(jìn)行了病菌的分離、純化和鑒定,最終獲得純化的煙草野火病菌與煙草角斑病菌。(2)對煙草野火病菌進(jìn)行普通PCR引物設(shè)計,最終得到煙草野火病的特異性引物40429,并驗證其特異性。試驗利用mavue2.3.1軟件進(jìn)行全基因組的比對,根據(jù)篩選出來的特異性區(qū)段,利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計引物。將設(shè)計的引物與對照菌株進(jìn)行普通PCR擴增對照,最終獲得了一組特異性引物。(3)試驗分別獲得了一組煙草野火病菌和一組煙草角斑病菌的LAMP引物。根據(jù)普通PCR特異性引物對應(yīng)的特異性區(qū)段,利用LAMP在線設(shè)計網(wǎng)站LAMP primer designing software PrimerExplorer V5,設(shè)計了煙草野火病菌LAMP檢測引物并進(jìn)行了驗證;由于缺少煙草角斑病菌的全基因組數(shù)據(jù),試驗通過利用煙草野火病菌的普通PCR引物對于煙草角斑病菌進(jìn)行擴增,同時對于擴增產(chǎn)物測序,并與煙草野火病菌的擴增產(chǎn)物測序結(jié)果相比對,最終獲得了煙草野火病與煙草角斑病存在的差異片段�；诖�,設(shè)計了煙草角斑病菌的特異性引物378/379/380/381,并驗證了引物的特異性。(4)建立并優(yōu)化了煙草野火病與煙草角斑病LMAP快速檢測體系�；贚AMP檢測體系中參與反應(yīng)的反應(yīng)物,對BST DNA Polymerase的使用量,dNTP的使用量,Mg~(2+)的使用濃度,甜菜堿的使用濃度,內(nèi)外引物的配比,反應(yīng)時長,反應(yīng)溫度等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,最終確定了最優(yōu)化的田間LAMP檢測工作濃度。(5)將建立的煙草野火病與煙草角斑病LAMP檢測體系與田間應(yīng)用相結(jié)合,驗證了檢測體系的可靠性。利用田間采樣的疑似染病葉片及健康葉片作為對照,通過和普通PCR、熒光定量PCR做對比,試驗最終確定了LAMP檢測體系的可靠性以及靈敏性。
【圖文】：

1 2 3 4 M 5 6 7 8析斑病菌的分離與鑒定培養(yǎng)平板上取混合菌液進(jìn)行 PCR 擴增，如圖 1 所示，以煙草野火，其能夠在引物 421/422 的作用下產(chǎn)生大小為 423 bp 大小的目的 的作用下產(chǎn)生大小為 1263 bp 大小的目的條帶；而含有煙草角斑6-8）在引物 421/422 的作用下產(chǎn)生 423 bp 大小的目的條帶，但下未產(chǎn)生 1263 bp 大小的條帶。說明混合菌液中含有煙草角斑病菌。

圖 2 煙草角斑病單斑 PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR product of P. syringae pv. angulata single spot為煙草野火病菌；2/8,3/9,4/10,5/11,6/12 模板為疑似煙草角斑病菌單斑；1-6 使用引物為引物 421/4使用引物為引物 423/424；M 為 DL2000 marker,7 template is P. syringae pv. tabaci. 2/8,3/9,4/10,5/11,6/12 template is suspected single spot of P. syringaeangulata. 1-6 using primer is 421/422. 7-12 using primer is 423/424. M is DL2000 marker.草角斑病菌的接種驗證化后培養(yǎng)的煙草角斑病菌接種到煙草葉片后，7 天后觀察發(fā)病情況，如圖后，，煙草葉片已經(jīng)發(fā)病，葉片有不規(guī)則的角狀病斑，根據(jù)煙草角斑病的田確定病斑為煙草角斑病病斑，證明純化的病菌即為煙草角斑病菌。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S435.72

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王永崇;;作物病蟲害分類介紹及其防治圖譜——煙草野火病及其防治圖譜[J];農(nóng)藥市場信息;2018年17期

2 陳燾;周瑋;李宏光;趙松義;蔡訓(xùn)輝;范彥君;周清明;;煙草野火病的發(fā)生及綜合防治研究進(jìn)展[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2018年01期

3 楊會麗;;不同藥劑對湘西地區(qū)煙草野火病的防治試驗[J];農(nóng)業(yè)工程;2016年06期

4 鄭慶偉;;目前登記防治煙草野火病的農(nóng)藥產(chǎn)品[J];山東農(nóng)藥信息;2016年06期

5 谷紀(jì)濤;丁偉;余永旭;王振國;肖鵬;羅建欽;李承榮;;煙草野火病對煙葉產(chǎn)量產(chǎn)值及化學(xué)成分的影響[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué);2017年04期

6 夏緯躍;盧寶慧;楊麗娜;南楠;劉燕妮;陳長卿;高潔;;吉林省煙草野火病菌群體分子多態(tài)性分析[J];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2014年05期

7 倪歡歡;何曉兵;帥紅;王振國;丁偉;;早期煙草野火病防治方法[J];植物醫(yī)生;2013年05期

8 楊麗娜;隋原;陳長卿;高潔;劉志友;隋策;;煙草野火病菌對春雷霉素的敏感性測定及敏感基線建立[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年05期

9 魏代福;張廣民;;山東主產(chǎn)煙區(qū)煙草野火病發(fā)病規(guī)律的調(diào)查研究[J];科技信息;2009年10期

10 薛志成;煙草野火病[J];農(nóng)家參謀;2004年05期

相關(guān)會議論文 前10條

1 王娜娜;肖崇剛;馬冠華;竇彥霞;;煙草野火病拮抗細(xì)菌的篩選及控病研究[A];中國植物病理學(xué)會2011年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2011年

2 姬廣海;張世光;劉雅婷;王紹坤;;云南煙草野火病的快速診斷[A];中國植物病理學(xué)會第七屆代表大會暨學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2002年

3 張世s

本文編號：2696256