【摘要】：楊樹是世界上適應(yīng)性最強、分布最廣的樹種。隨著楊樹人工林面積的不斷擴大,我國現(xiàn)擁有世界上面積最大的楊樹人工林。楊樹是一個易發(fā)生病蟲害的樹種,其中危害楊樹的致病菌株有300多種,我國報道存在的有110多種。在楊樹葉部病害中,落葉松-楊柵銹菌(Melampsora larici-populina)引起的楊樹葉銹病分布最廣、危害最大。通過落葉松楊柵銹菌E4強致病株系接種后兩個楊樹品種的癥狀及其間苯三酚染色判定雜交楊與E4銹菌互作為非親和型互作,歐美雜交楊與E4銹菌互作為親和型互作。以雜交楊為主要研究對象,歐美雜交楊作對照,對E4銹菌侵染后96 h兩個品種轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄因子參與雜交楊應(yīng)答E4銹菌侵染,其中NAC、WRKY、MYB、AP2和ERF所占比例較大。進一步對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中重要的5個轉(zhuǎn)錄因子家族進行分析發(fā)現(xiàn),大部分WRKY轉(zhuǎn)錄因子在雜交楊應(yīng)答E4銹菌12 h和96 h上調(diào)表達,起正向調(diào)控作用。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族屬于調(diào)控蛋白家族,是植物防御信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中至關(guān)重要的因子。以雜交楊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),鑒定到100個PdtWRKY基因,其中99個PdtWRKY基因分別對應(yīng)在毛果楊19條染色體上,PdtWRKY100定位于Scaffold_41。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明雜交楊接種E4銹菌后有53個基因差異表達(8個基因下調(diào),45個基因上調(diào)),選擇上調(diào)表達的基因進行進一步研究。對45個基因進行靶基因預(yù)測,其中有28個基因找到相應(yīng)的靶基因,共有305個靶基因,建立調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。對靶基因進行分類整理后,發(fā)現(xiàn)其中有21個靶基因具有轉(zhuǎn)錄因子活性,其中包括PdtWRKY64,它的上游基因為PdtWRKY86。PdtWRKY86在雜交楊接種E4銹菌后上調(diào)表達,轉(zhuǎn)錄調(diào)控唯一的靶基因PdtWRKY64,PdtWRKY64又轉(zhuǎn)錄調(diào)控18個基因,其中12個與植物抗病相關(guān)。由此表明PdtWRKY86具有多級調(diào)控網(wǎng)絡(luò),它的靶基因在雜交楊接種E4銹菌后也上調(diào)表達,因此篩選出PdtWRKY86基因作為研究對象。為明確PdtWRKY86基因在雜交楊與E4銹菌互作過程中的功能,克隆該基因、對7個時間點表達量進行分析并進行轉(zhuǎn)基因驗證。PdtWRKY86CDS全長為965 bp,編碼311個氨基酸。除6 h外其余6個時間點均上調(diào)表達,表明PdtWRKY86在雜交楊與E4銹菌非親和互作過程中起到正向調(diào)控作用。PdtWRKY86轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株較野生型擬南芥接種灰葡萄孢和致病疫霉后發(fā)病慢、病斑小,PdtWRKY86轉(zhuǎn)基因擬南芥較野生型擬南芥抗病性強,表明PdtWRKY86轉(zhuǎn)基因植物通過多級調(diào)控抗病相關(guān)基因的表達,提高轉(zhuǎn)基因植物的抗病性。綜上所述,證明PdtWRKY86是雜交楊-E4銹菌非親和型互作過程的正向調(diào)控因子。
【圖文】：

Ｅ４銹菌接種歐美雜交楊葉片后２邋ｈ銹菌孢子萌發(fā)，到２４邋ｈ葉片未發(fā)生明顯癥狀，逡逑４８邋ｈ葉片出現(xiàn)褪綠小斑點，％邋ｈ葉背出現(xiàn)明顯的黃色斑點并逐漸擴大，至１６８邋ｈ葉背形逡逑成多個夏孢子堆（圖２－１），此時Ｅ４銹菌完成夏孢子的生活史，判定歐美雜交楊為Ｅ４逡逑銹菌的親和型品種。Ｅ４銹菌接種雜交楊葉片后２邋ｈ銹菌孢子也萌發(fā)，至４８邋ｈ葉片均未逡逑觀察到明顯癥狀，９６邋ｈ葉背出現(xiàn)褪綠點斑并逐漸擴大，顏色變深，至１６８邋ｈ時葉背組織逡逑出現(xiàn)多處壞死斑點并產(chǎn)生少數(shù)夏孢子堆（圖２－１），判定雜交楊為Ｅ４銹菌的非親和型品逡逑種。逡逑ＣＫ邋２ｈ邋６ｈ邋１２邋ｈ邋２４邋ｈ邋４８邋ｈ邋９６邋ｈ邋１６８邋ｈ逡逑■■■■■■逡逑圖２－１邋Ｅ４銹菌接種楊樹葉片癥狀逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋Ｉｎｆｅｓｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｏｐｌａｒ邋ｌｅａｖｅｓ邋ｗｉｔｈ邋Ｅ４邋ｒｕｓｔ逡逑接種后的葉片經(jīng)過間苯三酚染色，葉片被染紅部分則為木質(zhì)素的積累。在歐美雜交逡逑楊接種葉片上發(fā)現(xiàn)，在２邋ｈ到２４邋ｈ葉片透明部分沒有明顯癥狀，葉脈呈紅色，４８邋ｈ葉片逡逑透明部分有深色斑點，逐漸擴大，９６邋ｈ葉片透明部分斑點增大，至１６８邋ｈ透明部分可以逡逑看到多個夏孢子堆，夏孢子堆呈棕色（圖２－２）。根據(jù)Ｃｅ＇ｃｉｌｅ邋Ｒｉｎａｌｄｉ等人研究表明木質(zhì)逡逑素在非親和型互作過程中銹菌侵染部位沉積較多１９１。歐美雜交楊葉片１６８邋ｈ木質(zhì)素積累逡逑較少

逑９６邋ｈ葉片透明部分有暗棕色小斑點，斑點逐漸擴大，至１６８邋ｈ時葉片透明部分可以看到逡逑大塊黃色壞死斑點和少數(shù)夏孢子堆（圖２－２）。雜交楊葉片１６８邋ｈ木質(zhì)素積累較多，葉片逡逑整個染為紅色，進一步判定雜交楊與Ｅ４銹菌互作為非親和型互作（ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ逡逑ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ邋）0逡逑ＣＫ邐２ｈ邐６邋ｈ邐１２邋ｈ邋２４邋ｈ邋４８邋ｈ邋９６邋ｈ邋１６８邋ｈ逡逑－邋；邋ｒ邋；邋ｖ邋＼：ｒ逡逑一逡逑圖２－２間苯三酚染色逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ逡逑２．２．２接種Ｅ４銹菌后表達差異的楊樹基因及ＧＯ富集分析逡逑經(jīng)過對９６邋ｈ兩個楊樹品種的ＣＫ組和接種組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，在接種Ｅ４銹菌后其逡逑表達量ｌｏｇ２（ｒｕｓｔ＋／ＣＫ）有差異，，并且差異極顯著（綜合數(shù)據(jù)中用ｘ２邋（／＾０．０１）確定）的楊逡逑樹基因共有１，２２８個。逡逑ＧＯ富集分析對１，邋２２８個基因進行注釋。與所有的差異表達的楊樹基因相比，其中逡逑２８１個基因顯著富集與ＤＮＡ依賴轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)（ＧＯ：邋０００６３５５，邋ｐ邋＝邋１．０ｅ－０７，邋ＦＤＲ邋＝逡逑１．６０ｅ－０５）。進一步富集２８１個基因后，與轉(zhuǎn)錄因子活性相關(guān)的１３８個基因（ＧＯ：逡逑０００３７００
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S763.7

【參考文獻】

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本文編號：2695560