【摘要】：楊樹是世界上適應(yīng)性最強(qiáng)、分布最廣的樹種。隨著楊樹人工林面積的不斷擴(kuò)大,我國現(xiàn)擁有世界上面積最大的楊樹人工林。楊樹是一個(gè)易發(fā)生病蟲害的樹種,其中危害楊樹的致病菌株有300多種,我國報(bào)道存在的有110多種。在楊樹葉部病害中,落葉松-楊柵銹菌(Melampsora larici-populina)引起的楊樹葉銹病分布最廣、危害最大。通過落葉松楊柵銹菌E4強(qiáng)致病株系接種后兩個(gè)楊樹品種的癥狀及其間苯三酚染色判定雜交楊與E4銹菌互作為非親和型互作,歐美雜交楊與E4銹菌互作為親和型互作。以雜交楊為主要研究對(duì)象,歐美雜交楊作對(duì)照,對(duì)E4銹菌侵染后96 h兩個(gè)品種轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄因子參與雜交楊應(yīng)答E4銹菌侵染,其中NAC、WRKY、MYB、AP2和ERF所占比例較大。進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中重要的5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),大部分WRKY轉(zhuǎn)錄因子在雜交楊應(yīng)答E4銹菌12 h和96 h上調(diào)表達(dá),起正向調(diào)控作用。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族屬于調(diào)控蛋白家族,是植物防御信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中至關(guān)重要的因子。以雜交楊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),鑒定到100個(gè)PdtWRKY基因,其中99個(gè)PdtWRKY基因分別對(duì)應(yīng)在毛果楊19條染色體上,PdtWRKY100定位于Scaffold_41。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明雜交楊接種E4銹菌后有53個(gè)基因差異表達(dá)(8個(gè)基因下調(diào),45個(gè)基因上調(diào)),選擇上調(diào)表達(dá)的基因進(jìn)行進(jìn)一步研究。對(duì)45個(gè)基因進(jìn)行靶基因預(yù)測,其中有28個(gè)基因找到相應(yīng)的靶基因,共有305個(gè)靶基因,建立調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。對(duì)靶基因進(jìn)行分類整理后,發(fā)現(xiàn)其中有21個(gè)靶基因具有轉(zhuǎn)錄因子活性,其中包括PdtWRKY64,它的上游基因?yàn)镻dtWRKY86。PdtWRKY86在雜交楊接種E4銹菌后上調(diào)表達(dá),轉(zhuǎn)錄調(diào)控唯一的靶基因PdtWRKY64,PdtWRKY64又轉(zhuǎn)錄調(diào)控18個(gè)基因,其中12個(gè)與植物抗病相關(guān)。由此表明PdtWRKY86具有多級(jí)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),它的靶基因在雜交楊接種E4銹菌后也上調(diào)表達(dá),因此篩選出PdtWRKY86基因作為研究對(duì)象。為明確PdtWRKY86基因在雜交楊與E4銹菌互作過程中的功能,克隆該基因、對(duì)7個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量進(jìn)行分析并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證。PdtWRKY86CDS全長為965 bp,編碼311個(gè)氨基酸。除6 h外其余6個(gè)時(shí)間點(diǎn)均上調(diào)表達(dá),表明PdtWRKY86在雜交楊與E4銹菌非親和互作過程中起到正向調(diào)控作用。PdtWRKY86轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株較野生型擬南芥接種灰葡萄孢和致病疫霉后發(fā)病慢、病斑小,PdtWRKY86轉(zhuǎn)基因擬南芥較野生型擬南芥抗病性強(qiáng),表明PdtWRKY86轉(zhuǎn)基因植物通過多級(jí)調(diào)控抗病相關(guān)基因的表達(dá),提高轉(zhuǎn)基因植物的抗病性。綜上所述,證明PdtWRKY86是雜交楊-E4銹菌非親和型互作過程的正向調(diào)控因子。
【圖文】：

Ｅ４銹菌接種歐美雜交楊葉片后２邋ｈ銹菌孢子萌發(fā)，到２４邋ｈ葉片未發(fā)生明顯癥狀，逡逑４８邋ｈ葉片出現(xiàn)褪綠小斑點(diǎn)，％邋ｈ葉背出現(xiàn)明顯的黃色斑點(diǎn)并逐漸擴(kuò)大，至１６８邋ｈ葉背形逡逑成多個(gè)夏孢子堆（圖２－１），此時(shí)Ｅ４銹菌完成夏孢子的生活史，判定歐美雜交楊為Ｅ４逡逑銹菌的親和型品種。Ｅ４銹菌接種雜交楊葉片后２邋ｈ銹菌孢子也萌發(fā)，至４８邋ｈ葉片均未逡逑觀察到明顯癥狀，９６邋ｈ葉背出現(xiàn)褪綠點(diǎn)斑并逐漸擴(kuò)大，顏色變深，至１６８邋ｈ時(shí)葉背組織逡逑出現(xiàn)多處壞死斑點(diǎn)并產(chǎn)生少數(shù)夏孢子堆（圖２－１），判定雜交楊為Ｅ４銹菌的非親和型品逡逑種。逡逑ＣＫ邋２ｈ邋６ｈ邋１２邋ｈ邋２４邋ｈ邋４８邋ｈ邋９６邋ｈ邋１６８邋ｈ逡逑■■■■■■逡逑圖２－１邋Ｅ４銹菌接種楊樹葉片癥狀逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋Ｉｎｆｅｓｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｏｐｌａｒ邋ｌｅａｖｅｓ邋ｗｉｔｈ邋Ｅ４邋ｒｕｓｔ逡逑接種后的葉片經(jīng)過間苯三酚染色，葉片被染紅部分則為木質(zhì)素的積累。在歐美雜交逡逑楊接種葉片上發(fā)現(xiàn)，在２邋ｈ到２４邋ｈ葉片透明部分沒有明顯癥狀，葉脈呈紅色，４８邋ｈ葉片逡逑透明部分有深色斑點(diǎn)，逐漸擴(kuò)大，９６邋ｈ葉片透明部分斑點(diǎn)增大，至１６８邋ｈ透明部分可以逡逑看到多個(gè)夏孢子堆，夏孢子堆呈棕色（圖２－２）。根據(jù)Ｃｅ＇ｃｉｌｅ邋Ｒｉｎａｌｄｉ等人研究表明木質(zhì)逡逑素在非親和型互作過程中銹菌侵染部位沉積較多１９１。歐美雜交楊葉片１６８邋ｈ木質(zhì)素積累逡逑較少

逑９６邋ｈ葉片透明部分有暗棕色小斑點(diǎn)，斑點(diǎn)逐漸擴(kuò)大，至１６８邋ｈ時(shí)葉片透明部分可以看到逡逑大塊黃色壞死斑點(diǎn)和少數(shù)夏孢子堆（圖２－２）。雜交楊葉片１６８邋ｈ木質(zhì)素積累較多，葉片逡逑整個(gè)染為紅色，進(jìn)一步判定雜交楊與Ｅ４銹菌互作為非親和型互作（ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ逡逑ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ邋）0逡逑ＣＫ邐２ｈ邐６邋ｈ邐１２邋ｈ邋２４邋ｈ邋４８邋ｈ邋９６邋ｈ邋１６８邋ｈ逡逑－邋；邋ｒ邋；邋ｖ邋＼：ｒ逡逑一逡逑圖２－２間苯三酚染色逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ逡逑２．２．２接種Ｅ４銹菌后表達(dá)差異的楊樹基因及ＧＯ富集分析逡逑經(jīng)過對(duì)９６邋ｈ兩個(gè)楊樹品種的ＣＫ組和接種組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，在接種Ｅ４銹菌后其逡逑表達(dá)量ｌｏｇ２（ｒｕｓｔ＋／ＣＫ）有差異，，并且差異極顯著（綜合數(shù)據(jù)中用ｘ２邋（／＾０．０１）確定）的楊逡逑樹基因共有１，２２８個(gè)。逡逑ＧＯ富集分析對(duì)１，邋２２８個(gè)基因進(jìn)行注釋。與所有的差異表達(dá)的楊樹基因相比，其中逡逑２８１個(gè)基因顯著富集與ＤＮＡ依賴轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)（ＧＯ：邋０００６３５５，邋ｐ邋＝邋１．０ｅ－０７，邋ＦＤＲ邋＝逡逑１．６０ｅ－０５）。進(jìn)一步富集２８１個(gè)基因后，與轉(zhuǎn)錄因子活性相關(guān)的１３８個(gè)基因（ＧＯ：逡逑０００３７００
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S763.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2695560