【摘要】：蚜蟲是一類屬于半翅目的小型昆蟲,其通過刺吸式口器直接取食植物汁液并傳播各種植物病毒對作物生產(chǎn)造成損失,是主要的農(nóng)業(yè)害蟲之一。豌豆蚜具有蚜蟲類的許多典型特征,如翅型和體色分化、孤雌生殖和有性生殖等多型現(xiàn)象;豌豆蚜的全基因組序列已經(jīng)公布,許多個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也已經(jīng)公布,是開展蚜蟲分子生物學(xué)研究的理想對象。RNAi作為一種研究基因功能的重要技術(shù),在昆蟲中已得到了廣泛的應(yīng)用。但在目前的研究表明RNAi效率在不同昆蟲中變化很大,多種主要類群昆蟲之中RNAi效率相對較低,嚴(yán)重阻礙了此項技術(shù)的廣泛應(yīng)用。在豌豆蚜中已利用RNAi研究了多個基因的功能,然而不同研究結(jié)果之間RNAi效率差異很大,有些結(jié)果甚至存在沖突,考慮到蚜蟲在自然存在的種群多樣以及多型情況,我們還不清楚蚜蟲RNAi效率的變化是否與其不同多型存在關(guān)聯(lián)。為了闡明這一問題,我們首先選擇了在果蠅等多種昆蟲之中被普遍用作表型標(biāo)記的yellow和white基因,利用注射法RNAi技術(shù)在豌豆蚜不同多型組合之中(綠色有翅/無翅型、紅色有翅/無翅型)的效率差異進(jìn)行了比較。研究發(fā)現(xiàn),靶標(biāo)基因的dsRNA僅在綠色型無翅蚜之中誘導(dǎo)了靶標(biāo)基因表達(dá)水平的降低,且在導(dǎo)入48小時后目標(biāo)基因的表達(dá)水平即恢復(fù)正常,而在其它多型組合的蚜蟲之中相關(guān)基因的表達(dá)并未受到影響;同時我們還檢測了注射上述基因的dsRNA后蟲體內(nèi)相關(guān)RNAi作用通路之中關(guān)鍵分子(Sid-1、Ago-2、R2D2、DcR-1)的表達(dá)情況,僅Sid-1和Ago-2基因的表達(dá)水平被上調(diào),其它基因的表達(dá)并未有顯著的變化。這些結(jié)果表明,RNAi效率在不同多型豌豆蚜之中存在差異,但是與體色和翅型組合的多型之間并無顯著的相關(guān)性,且RNAi通路分子之中僅有部分基因的表達(dá)與目標(biāo)基因抑制相關(guān)。綜合不同多型中這兩個基因的RNAi效率,可以發(fā)現(xiàn)RNAi效率在豌豆蚜各多型之中普遍較低,這提示存在于血淋巴之中的一些核酸酶可能參與了細(xì)胞外dsRNA的降解。我們以綠色型豌豆蚜為對象,又進(jìn)一步研究了不同翅型中血淋巴在體外對不同基因dsRNA的降解能力,研究發(fā)現(xiàn)dsRNA的降解效率與血淋巴之中相關(guān)酶的含量密切相關(guān),高濃度的血淋巴提取液均能快速的降解dsRNA,無翅蚜與有翅蚜相比,其血淋巴降解dsRNA的速率稍慢一些。上述實驗結(jié)果說明,在豌豆蚜中RNAi效率較低是一種在各多型之中普遍存在的客觀現(xiàn)象,血淋巴之中的相關(guān)核酸酶類可能是影響RNAi效率的關(guān)鍵。因此,我們通過轉(zhuǎn)錄組分析比較導(dǎo)入dsRNA不同時間之后相關(guān)基因的表達(dá)情況,并結(jié)合豌豆蚜全基因組篩選的方法,試圖找到可能影響豌豆蚜RNAi效率的相關(guān)核酸酶。然而轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)任何相關(guān)核酸酶的基因,但是通過全基因組篩選的方法我們找到了5個潛在的核酸酶基因,并通過RT-PCR方法在血淋巴中初步確定了兩個潛在的核酸酶基因的表達(dá),其具體功能有待于進(jìn)一步深入的研究。上述兩項研究表明,RNAi效率雖然在不同多型豌豆蚜之中存在一定的差異,但整體而言RNAi效率均相對較低,這極大地阻礙了利用此項技術(shù)對豌豆蚜相關(guān)基因功能的研究,基于DNA編輯的CRISPR/Cas9技術(shù)為我們提供了新的契機(jī)。目前在多種昆蟲之中已經(jīng)應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行了成功的基因編輯,已有的實驗表明昆蟲CRISPR/Cas9成功的關(guān)鍵點之一是要將sgRNA和Cas9蛋白在囊胚期之前注射入卵內(nèi)。而實驗室的豌豆蚜種群一般都是孤雌生殖,因此要開展蚜蟲的基因編輯實驗,首先需要誘導(dǎo)孤雌蚜產(chǎn)生有性蚜,有性蚜交配后產(chǎn)卵,而蚜蟲卵一般必須要經(jīng)過3個月左右時間才能孵化出來干母蚜,因此明確豌豆蚜產(chǎn)卵規(guī)律是開展CRISPR/Cas9實驗的關(guān)鍵之一。對孤雌蚜分別進(jìn)行不同的低溫短光照處理,在第三代誘導(dǎo)得到雄蚜和性雌蚜,不同性比(1雌1雄和2雌1雄)交配后,我們發(fā)現(xiàn)從產(chǎn)第一粒卵開始,1雌1雄比例每日單雌產(chǎn)卵數(shù)均高于2雌1雄比例單雌產(chǎn)卵數(shù),但單雌每日產(chǎn)卵量均較低。因此,獲得足夠的雄蚜和性雌蚜是收集大量早期胚胎的關(guān)鍵。另外,1雌1雄交配后每天日間的產(chǎn)卵數(shù)要高于夜間,而2雌1雄交配后每日晝夜產(chǎn)卵出無差異。然后,我們檢測了4℃滯育不同時期后的卵孵化率,結(jié)果表明,卵在4℃分別滯育90天、100天和110天后孵化率分別為52.3%,49.2%和57.6%,孵化率間無顯著差異,考慮到實驗周期和卵在滯育時的消耗,低溫滯育90天可作為CRISPR實驗應(yīng)用時卵滯育的時間。綜上所述,不同多型間的豌豆蚜RNAi效率的確存在差異,但普遍表現(xiàn)出RNAi效率較低的特性。血淋巴之中存在的能夠快速降解dsRNA的核酸酶可能是影響豌豆蚜RNAi效率的關(guān)鍵之一,對相關(guān)酶類基因功能的進(jìn)一步研究將有助于闡明這一問題。采用CRISPR/Cas9技術(shù)為研究蚜蟲基因功能的關(guān)鍵之一是要獲取囊胚期的卵,豌豆蚜較低的日均產(chǎn)卵量表明獲取充足的雌性蚜和雄性蚜是獲得充足卵的關(guān)鍵。本研究為準(zhǔn)確評估RNAi技術(shù)在蚜蟲基因功能研究和促進(jìn)新型CRISPR/Cas9技術(shù)在蚜蟲功能基因解析方面的應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S433.3

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