【摘要】：由條形柄銹菌(Puccinia striiformis Westend.f.sp.tritici Eriks,Pst)引起的小麥條銹病,其病原菌是專一性的氣傳性真菌,有易傳染、易突變等特點(diǎn)。不斷有新的條銹菌小種出現(xiàn),是造成小麥條銹病的大規(guī)模爆發(fā),引起小麥產(chǎn)量的嚴(yán)重下降的重要原因。條銹菌侵染小麥?zhǔn)峭ㄟ^專一性的侵染器官——吸器完成的,它由吸器的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、寄主細(xì)胞的細(xì)胞膜形成頸型,使其成為一個(gè)封閉的、寄主細(xì)胞非原生的結(jié)構(gòu)。吸器通過向寄主細(xì)胞分泌效應(yīng)蛋白,改變寄主的防御反應(yīng),從而向寄主吸收營養(yǎng)物質(zhì)和能量,完成小麥的侵染過程。效應(yīng)蛋白是病原菌產(chǎn)生的,能夠改變宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的小分子蛋白,它可以與寄主細(xì)胞的大分子發(fā)生相互作用,改變寄主細(xì)胞的防御反應(yīng),達(dá)到侵染的目的。小麥條銹菌效應(yīng)蛋白Pst-1374來源于條銹菌美國小種PST-78夏孢子的cDNA文庫,含有109個(gè)氨基酸,其中有6個(gè)半胱氨酸。在前期研究中,發(fā)現(xiàn)Pst-1374在本氏煙上的瞬時(shí)表達(dá)能夠抑制BAX蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死;Pst-1374也能抑制寄主的效應(yīng)子觸發(fā)免疫(Effector-Triggered Immunity,ETI)反應(yīng),表現(xiàn)在活性氧和壞死面積的減少。從條銹菌與小麥互作的非親和的cDNA文庫中用酵母雙雜篩選、進(jìn)一步用Pull down進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)Pst-1374與小麥葉綠體硫氧還蛋白TaTrxm能發(fā)生互作,也可以和自身互作。能和自身互作的結(jié)果,提示其可能是以多聚體的形式存在;其次Pst-1374富含半胱氨酸并且能和硫氧還蛋白互作,而硫氧還蛋白能解開二硫鍵。因此我們提出猜測:Pst-1374可能通過二硫鍵形成多聚體,TaTrxm通過打開二硫鍵使Pst-1374解聚成單體從而行使其功能。本研究利用原核表達(dá)體外純化效應(yīng)蛋白Pst-1374與靶標(biāo)蛋白TaTrxm,使用生物化學(xué)與結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法,如:凝膠過濾層析(Gel Filtration Chromatography,GFC)、硫氧還蛋白活力測定、圓二色譜(Circular Dichroism,CD)、動(dòng)態(tài)光散射(Dnamic Light Scattering,DLS)等技術(shù)測定Pst-1374與靶標(biāo)蛋白TaTrxm的互作模式,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.成功構(gòu)建了Pst-1374和TaTrxm的原核表達(dá)載體;通過Ni柱和高效液相色譜對(duì)Pst-1374進(jìn)行純化;通過直鏈淀粉柱對(duì)TaTrxm進(jìn)行純化,得到電泳純的蛋白。2.結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)Pst-1374整體結(jié)構(gòu)松散,只有小部分α-螺旋結(jié)構(gòu),大部分為無規(guī)則卷曲;通過圓二色譜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Pst-1374的α-螺旋結(jié)構(gòu)能被三氟乙醇(Trifluoroethanol,TFE)誘導(dǎo)產(chǎn)生,NaCl濃度能改變Pst-1374的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成;動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Pst-1374在溶液中存在兩種粒徑分子。凝膠過濾層析實(shí)驗(yàn)證明Pst-1374是多聚體,二硫鍵參與多聚體的形成。3.TaTrxm的牛胰島素實(shí)驗(yàn)證明了其具有硫氧還蛋白的活性;TaTrxm與Pst-1374反應(yīng)實(shí)驗(yàn)證明了TaTrxm能通過打開二硫鍵解聚Pst-1374,證明Pst-1374通過與TaTrxm互作使多聚體打開行。通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們可以證明Pst-1374在溶液中通過二硫鍵形成多聚體,以多聚物的形式存在。TaTrxm與Pst-1374作用可以打開Pst-1374的二硫鍵,使多聚物發(fā)生解聚。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果能夠證明我們提出的“Pst-1374可能通過二硫鍵形成多聚體,TaTrxm通過打開二硫鍵使Pst-1374解聚成單體”的猜測,為后續(xù)研究Pst-1374如何改變宿主小麥防御機(jī)制提供思路。
【圖文】：

圖 1-1 小麥銹病發(fā)育階段的示意圖Figure 1-1 Aschematic diagram of the development stage of wheat rust1.2 效應(yīng)蛋白的致病機(jī)理1 2 1 效應(yīng)蛋白的定義效應(yīng)蛋白通常出現(xiàn)在植物和病原菌之間相互作用領(lǐng)域，通常將其定義為“病原產(chǎn)生的，改變寄主細(xì)胞防御機(jī)制的小分子”(Stergiopouloset al.,2009)。效應(yīng)蛋白的現(xiàn)，解決了植物和真菌互作中“無毒因子”和“激發(fā)子”不能共存的現(xiàn)狀(Stergiopoulet al., 2009)。效應(yīng)蛋白通常通過其自身的功能或者其在寄主細(xì)胞的活動(dòng)來命名，其名通常揭示了其自身的特點(diǎn)及其功能。在植物和病原菌的互作進(jìn)化中，效應(yīng)蛋白通常要面對(duì)來自寄主細(xì)胞的惡劣生存境，這使得它不得不進(jìn)化出更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)來面對(duì)這些困難，二硫鍵的增加是一種效的辦法，半胱氨酸形成的二硫鍵有更加牢固的分子鍵，能夠更好的穩(wěn)定效應(yīng)蛋白三維結(jié)構(gòu)，發(fā)揮其功能(Martin et al., 2008； Sébastien et al., 2011)；許多的效

分子在一定時(shí)間的移動(dòng)與其分子大小有關(guān)，粒徑大的分子比粒徑小的分子此，為保證分子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)相同，通常采用不同強(qiáng)度的散射光。動(dòng)態(tài)光散射光時(shí)遇到分子，，入射光散射強(qiáng)度與分子大小有相關(guān)性(Stetefeld et al., 201實(shí)驗(yàn)思路和設(shè)計(jì)麥條銹菌通過其吸器向寄主細(xì)胞分泌效應(yīng)蛋白達(dá)到其增殖的目的。通過前小種 PST-78 的分泌組進(jìn)行測序、篩選，我們找到效應(yīng)蛋白 Pst-1374 在病原中發(fā)揮著重要作用。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn) Pst-1374 在本氏煙上的瞬時(shí)表達(dá)能 蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死；利用農(nóng)桿菌在煙草上瞬時(shí)表達(dá)發(fā)現(xiàn) Pst-1374 定位于發(fā)現(xiàn) Pst-1374 能抑制寄主的 ETI 反應(yīng)；從條銹菌與小麥互作的非親和的 cD篩選和酵母雙雜鑒定，發(fā)現(xiàn) Pst-1374 可以和小麥葉綠體硫氧還蛋白 TaTrx生互作。Pst-1374 在侵染過程中發(fā)揮著如此重要作用，那它與其靶標(biāo) TaTrx作的？我們通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物化學(xué)兩方面的技術(shù)對(duì) Pst-1374 在發(fā)揮功進(jìn)行研究，下圖是本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)圖：
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S435.121.42

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本文編號(hào)：2678014