【摘要】：番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)是布尼亞病毒目(Bunyavirales)番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)的代表成員,是世界上危害最大的十種植物病毒之一。辣椒是我國(guó)重要的蔬菜經(jīng)濟(jì)作物,而重慶是我國(guó)辣椒的主產(chǎn)區(qū)和集中消費(fèi)區(qū)之一,辣椒是重慶重點(diǎn)發(fā)展的農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)。2015年本實(shí)驗(yàn)室在重慶地區(qū)的辣椒上檢出TSWV,目前該病毒已在重慶地區(qū)廣泛發(fā)生。明確重慶地區(qū)辣椒品種對(duì)TSWV的抗病性,可為育種工作者提供科學(xué)依據(jù),對(duì)于防止TSWV在重慶辣椒上的流行具有重要意義。本研究通過(guò)對(duì)重慶主栽辣椒品種進(jìn)行人工摩擦接種TSWV,利用斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附法(Dot enzyme linked immunosorbent assay,Dot-ELISA)和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)對(duì)主栽辣椒品種進(jìn)行抗病性分析,結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)(Real-time quantitative RT-PCR,RT-qPCR)對(duì)不同主栽辣椒品種中TSWV的積累量進(jìn)行了分析,結(jié)合癥狀觀察及發(fā)病情況來(lái)確定重慶主栽辣椒品種的抗病性;最后對(duì)TSWV在不同抗病性辣椒上的遺傳變異進(jìn)行了分析。本研究以8種不同重慶主栽辣椒品種:渝辣10號(hào)、渝椒12號(hào)、渝椒五號(hào)、艷椒425、早春、艷椒11、艷椒417、農(nóng)世纓朝天椒為試驗(yàn)材料,經(jīng)人工接種TSWV,20天后進(jìn)行Dot-ELISA檢測(cè)和RT-PCR檢測(cè)及抗病性調(diào)查,結(jié)果顯示:Dot-ELISA的檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果一致;艷椒417的發(fā)病率和病情指數(shù)分別為51.4%和61.11,在所檢測(cè)的8個(gè)品種中發(fā)病最嚴(yán)重,是對(duì)TSWV最為敏感的品種;其次是艷椒425,發(fā)病率和病情指數(shù)為48.6%和45.56;渝辣10號(hào)、渝椒12號(hào)和朝天椒對(duì)TSWV的抗病性次之;而早春和渝椒5號(hào)對(duì)TSWV抗病性相對(duì)較強(qiáng);艷椒11對(duì)TSWV的相對(duì)抗病性最強(qiáng),發(fā)病率和病情指數(shù)分別為17.1%和25.00。為了進(jìn)一步明確8種不同重慶主栽辣椒品種對(duì)TSWV的抗病性,本研究利用RT-qPCR技術(shù)分析不同品種辣椒中病毒的積累量,進(jìn)一步比較各辣椒品種對(duì)TSWV的抗病性。結(jié)果顯示,在8個(gè)不同的辣椒品種中,TSWV積累量最高的是艷椒417;其次是朝天椒和艷椒425;渝辣10號(hào)和渝椒12號(hào)的病毒積累量也較高;早春和渝椒5號(hào)的相對(duì)較低;而艷椒11中TSWV的積累量最低。結(jié)合癥狀觀察及發(fā)病情況分析,進(jìn)一步確認(rèn)艷椒417對(duì)TSWV最敏感,艷椒11對(duì)TSWV表現(xiàn)相對(duì)較強(qiáng)的抗病性。在辣椒接種TSWV后15天(dpi)、30 dpi、60 dpi、85 dpi、100dpi、150 dpi分別檢測(cè)不同辣椒品種中TSWV的積累量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同的品種在接種后均表現(xiàn)出TSWV積累量先增加后下降的趨勢(shì);其中,艷椒417、渝辣10號(hào)、艷椒425、早春和紅纓朝天椒在60 dpi時(shí)達(dá)到TSWV積累的最高峰;而艷椒11、渝椒12號(hào)和渝椒5號(hào)在85 dpi時(shí)達(dá)到TSWV積累的最高峰。艷椒417和艷椒11均為重慶辣椒品種,但抗病性差異很大,為了明確TSWV在這兩個(gè)辣椒品種中的變異水平,本研究以不同抗病性的辣椒品種艷椒417和艷椒11為材料,分別接種TSWV,擴(kuò)增了接種植株中TSWV的非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructure protein,NSs)基因,構(gòu)建了艷椒417早期(50 dpi)、后期(150 dpi),艷椒11早期(50 dpi)、后期(150 dpi)4個(gè)種群,并對(duì)這4個(gè)種群的遺傳結(jié)構(gòu)及變異進(jìn)行了分析。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),TSWV NSs基因組種群在不同抗病性的辣椒上的遺傳多樣性不同,TSWV NSs基因組種群在艷椒417上的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為:0.284±0.102、0.00068±0.00042;在艷椒11上的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為:0.649±0.086、0.00088±0.00022。且TSWV NSs基因在這兩種辣椒上未檢測(cè)到重組現(xiàn)象。這4個(gè)種群的遺傳結(jié)構(gòu)符合病毒“準(zhǔn)種”特征,艷椒11早期、艷椒11后期、艷椒417早期、艷椒417后期種群的突變克隆百分率分別為42.10%、38.89%、6.67%、16.67%;各突變頻率分別為5.30×10~(-4)、4.43×10~(-4)、1.32×10~(-4)、1.48×10~(-4),可以看出TSWV NSs基因組種群在艷椒11上的遺傳變異水平高于艷椒417。對(duì)4個(gè)種群的主序列兩兩對(duì)比發(fā)現(xiàn),艷椒11早期和晚期的主序列同源率為100%,艷椒417的早期和晚期的主序列同源率也為100%,但是將艷椒11主序列、艷椒417主序列及接種本氏煙上的NSs基因序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)在1500 bp的序列上的766核苷酸位點(diǎn)艷椒11上TSWV NSs基因發(fā)生了A→G的突變類(lèi)型,而艷椒417及接種本氏煙上的TSWV NSs基因沒(méi)有發(fā)生突變,而這一位點(diǎn)的突變導(dǎo)致谷氨酸變?yōu)榱烁拾彼帷＞C上所述,本研究明確了8種重慶主栽辣椒品種對(duì)TSWV的抗病情況,其中艷椒417對(duì)TSWV的侵染最敏感,而艷椒11表現(xiàn)出最強(qiáng)的相對(duì)抗病性;對(duì)TSWV在艷椒417和艷椒11中遺傳變異情況的分析表明,TSWV在艷椒11上的遺傳變異更為豐富。本研究對(duì)抗TSWV辣椒品種的選育以及TSWV引致病害的有效防控具有一定的參考價(jià)值。
【圖文】：

利用 TSWV 的特異性血清進(jìn)行 Dot-ELISA 檢測(cè)。結(jié)果表明，在所檢測(cè)的 8 個(gè)品種中，艷椒 417 是對(duì) TSWV 最為敏感的品種，檢出率最高為 51.4%；其次是艷椒 425，檢出率為 48.6%；朝天椒、渝椒 12 號(hào)和渝辣 10 號(hào)對(duì) TSWV 也較為敏感，檢出率分別為 37.1%、34.2%和 28.6%；渝椒五號(hào)和早春的檢出率相對(duì)較低，分別為 22.9%、20%；艷椒 11 的檢出率最低，僅為 17.1%（表 2-2）。表 2-2 不同品種辣椒接種 TSWV 后 ELISA 檢測(cè)結(jié)果Tab.2-2 The Detection of TSWV by ELISA in infected peper辣椒品種 渝椒 12 號(hào) 渝辣 10 號(hào) 渝椒五號(hào) 艷椒 417 艷椒 11 艷椒 425 早春 接種總株數(shù) 35 35 35 35 35 35 35 發(fā)病株數(shù) 12 10 8 18 6 17 7 檢出率（%） 34.2 28.6 22.9 51.4 17.1 48.6 20 3.1.2 接種 TSWV 的不同品種辣椒 RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果采取 7 dpi 和 20 dpi 時(shí)不同主栽辣椒品種（每個(gè)品種 7 份樣品，5 次生物學(xué)重復(fù)）的葉片，用 Trizol 法提取辣椒葉片總 RNA，電泳后可以看到清晰的三條帶：28S、18S、5S（圖 2-1），說(shuō)明提取總 RNA 的質(zhì)量比較好，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

第二章 重慶主栽辣椒對(duì) TSWV 的抗性評(píng)價(jià)以辣椒總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄后，用擴(kuò)增TSWV的特異性引物TSWV CP-F/R：GAAGCAATAAGAGGTAAG/TGCTTTGTTGACACAAGGCA，，對(duì)接種的不同品椒樣品進(jìn)行 RT-PCR 反應(yīng)（每個(gè)品種 35 份樣品）。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示， 417 檢出率為 51.4%；艷椒 425 為 48.6%；朝天椒檢出率為 37.1%；渝椒 12出率為 34.2%；渝辣 10 號(hào)檢出率 28.6%；渝椒 5 號(hào)和早春的檢出率相對(duì)較低，為 22.9%、20%；艷椒 11 的檢出率最低，僅為 17.1%（圖 2-2）。和 ELISA 檢果一致。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S436.418

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本文編號(hào)：2676880