【摘要】：柑橘黃龍病(HLB)是威脅全球柑橘產業(yè)健康發(fā)展的毀滅性病害,由于HLB病菌尚無法獲得離體純培養(yǎng),因而導致其生物學特性、遺傳變異規(guī)律、致病分子機制及病害流行規(guī)律等方面的研究均未取得突破性進展。HLB菌全基因組序列的公布為開展HLB菌遺傳多樣性研究、尋找基因變異位點和種群分化等研究提供了理論參考。本研究對我國柑橘黃龍病菌原噬菌體多樣性和SOS應答(SOS response,SOSr)轉錄調控因子方面開展了系統(tǒng)研究,獲得的主要研究結果如下:1.通過對來自中國不同地理來源的234份確定為HLB陽性的樣品進行噬菌體種類鑒定,發(fā)現(xiàn)SC1和SC2噬菌體普遍存在于本研究所收集的6個不同地理來源的黃龍病菌分離物中,包括廣東長春花(Catharanthus roseus)分離物和江西贛州臍橙(Citrus sineses Osbeck cv.)分離物、福建永春蘆柑(Citrus madurensis Lour)分離物、湖南宜章臍橙(Citrus sineses Osbeck cv.)分離物、廣東果樹所砂糖橘(Citrus reticulate Blanco cv.)分離物、云南保山檸檬(Citrus limon(L.)Osbeck)以及北沙水檸檬(Citrus limon(L.)Osbeck)和海南瓊中綠橙(Citrus sinensis Osbeck cv.)分離物。在所有樣品中SC2檢出率達到96.15%,而SC1噬菌體檢出率為55.56%,低于SC2噬菌體的檢出率。進一步通過對菌株CLas str.UF506中原噬菌體SC2膠原三螺旋重復(Collagen triple helix repeat,Cthr)蛋白特異基因進行擴增和序列比對發(fā)現(xiàn),在云南檸檬分離物中有多條帶共存現(xiàn)象,且比例達到81.08%;其它地理來源樣品中少數(shù)也存在多條帶共存現(xiàn)象,大部分分離物以單一條帶為主,且相較于其他含有多條帶的樣品,云南檸檬分離物中的多條帶亮度均一,無明顯主帶、次帶之分,經分析發(fā)現(xiàn)造成序列出現(xiàn)差異的原因是cthr基因中存在一個18 bp的微型跳躍轉座子序列,該微型跳躍轉座子序列規(guī)律性插入兩個相鄰的GAGGTCCTT或TAGGTCCTT與GAGGTCCTT之間,其重復數(shù)介于1~22個不等。通過系統(tǒng)進化分析證實所有云南檸檬分離物與美國長春花樣品聚為一簇,均與GenBank中原噬菌體CLas str.UF506(登錄號:HQ377374)中的SC2(登錄號:HQ377373)聚為同一分支;而其他地理來源樣品同代表菌株CLas str.gxpsy(登錄號:CP004005)和CLas str.A4(登錄號:CP010804)含有的噬菌體聚為一簇,證實了云南HLB樣品含有的噬菌體具有更豐富的遺傳多樣性。2.通過對LexA_(CLas)基因的擴增和克隆測序驗證,明確了我國CLas分離物中不含有LexA保守結構域。結合噬菌體相對表達量進一步對全基因組范圍內內22個轉錄調控因子及延伸因子(EF-Tu)和SOSr激活蛋白(RecA)相關基因應答SOS處理時的差異表達進行了系統(tǒng)的分析,處理包括絲裂霉素C(Mitomycin C,MMC)處理、紫外線(UV)處理和熱處理。結果證實:上述24個轉錄調控相關基因中NusG、CarD、NusA、RS8、MraZ和EF-Tu為有明顯差異表達的基因。對這些基因進行進一步的qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn):1)MMC處理樣品中,當MMC濃度為15μg/mL處理1.5 d時噬菌體表達量最高,轉錄調控因子CarD和MraZ此時同樣上調表達,所以很有可能代替LexA響應SOSr。2)UV處理樣品中,輻射0 min~30 min時在10 min和30 min時呈現(xiàn)上調調表達,其他時間點均為下調表達,而轉錄調控因子RS8、EFTu、MraZ、RS1和RS9呈現(xiàn)出相同的表達趨勢,所以很有可能共同作用響應SOSr。3)熱處理樣品中,當溫度為25°C時均呈現(xiàn)下調表達,當溫度為37°C時樣品中噬菌體隨著時間的延長表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,且均呈上調表達,且表達量達到14~30倍,轉錄調控因子NusG、NusA、CarD、RS8、MraZ和EFTu均在25°C處理2 d和37°C處理時均呈上調表達,所以很有可能共同作用響應SOSr。綜合上述結果,對三種SOS誘導處理均有應答的調控因子有CarD和MraZ,很有可能在響應SOS應答中起主要作用。
【圖文】：

圖 1.1 柑橘黃龍病的癥狀特點Fig. 1.1 Symptoms caused by citrus Huanglongbing bacteria (圖：徐國亮，拍攝時間：2016.6~2017.31.2.2 黃龍病命名及危害柑橘黃龍病在我國發(fā)現(xiàn)已久，最早在潮汕地區(qū)當?shù)厝朔Q“黃梢病”，但粵語發(fā)音類似于“黃龍病”，之后在世界各國陸續(xù)有發(fā)現(xiàn)相似癥狀但命名各不相同( Obergolzer et al 1965, Aubert et al 1985, Graca 1991)，隨著研究者對 HLB 的病原和寄主的認識逐漸深入，直到 1995 年召開的第十三屆國際柑橘病毒學會（IOCV）會議才正式命名為黃龍�。℉uanglongbing, HLB）(Bové2006, 范國成等 2009)。由于目前尚無特效藥劑和抗病品種，該病的防治仍然十分困難，如果被 HLB 感染，切實可行的辦法是挖除病樹并及時銷毀。浙江臺州 2002 年首次遭受 HLB 入侵，但由于沒有引起足夠的重視及缺乏有效的防控措施，至 2016 年病情嚴重，全市共挖除具有明顯癥狀病樹 500 多萬株，給當?shù)馗涕佼a業(yè)造成了毀滅性的災害，后來對成片柑橘

華中農業(yè)大學 2018 屆碩士研究生學位（畢業(yè)）論文脅迫并對 DNA 造成損傷或復制受阻形成暴露單鏈 DNA（single stranded DNDNA）時，大量 ssDNA 的聚集導致 RecA（recombinase A）變成一種激活狀態(tài)ssDNA結合形成RecA-ssDNA核酸蛋白復合物，促使阻遏蛋白LexA二聚體降解而 SOS 相關基因啟動，導致包括 RecA 和 LexA 在內的大約 30 個對 DNA 損傷修復的SOS蛋白被誘導表達(Schmidt andChamberlin 1984, Kuzminov 1999, Na al 2001, 周慶等 2007)，這是一種變異率極高的易錯修復方式，可以使細胞存活加，突變率也增加。當修復完成后，RecA-ssDNA 復合物分解，，RecA 活性減到誘導表達的基因恢復到本底水平，LexA 重新積累并結合在 SOS 基因啟動子的雙鏈 DNA 上，從而 SOS 相關基因表達再次受到抑制(Witkin 1976)，如圖 1.。
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S436.66

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