【摘要】：褐飛虱Nilaparvata lugens St?l屬半翅目同翅亞目飛虱科,是我國乃至亞洲最為嚴(yán)重的水稻害蟲。褐飛虱通過刺吸為害水稻,并可傳播病害如水稻鋸齒葉矮縮病(Rice Ragged Stunt Virus,RRSV)等。不僅如此,褐飛虱的排泄物中含有多種氨基酸和蜜露,常常會引發(fā)霉菌滋生,使得水稻大幅度減產(chǎn)。到目前為止,我國防治褐飛虱的常規(guī)手段是農(nóng)藥防治,但這帶來了褐飛虱的抗藥性和環(huán)境污染等問題。作為半翅目刺吸性昆蟲,褐飛虱食性單一,僅取食水稻韌皮部汁液為生,營養(yǎng)缺乏,但其體內(nèi)存在類酵母共生菌(Yeast-like Symbionts,YLS),可以為其提供必需氨基酸、膽固醇,并且可以加速氮循環(huán),參與卵黃原沉淀等。在褐飛虱雌成蟲羽化后2天起,脂肪體中的YLS釋放到血淋巴中,并經(jīng)由卵巢小管的上皮栓(epithelial plug,EP)入侵卵巢,從而進(jìn)入卵母細(xì)胞,完成經(jīng)卵傳播,說明上皮栓在YLS經(jīng)卵垂直傳播中起著關(guān)鍵作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),間α胰蛋白酶基因(inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 4,ITIH4)在褐飛虱原羽化后第2天,表達(dá)量顯著上升,說明其可能與褐飛虱生殖相關(guān),也可能與YLS入侵卵巢有關(guān)。本文對褐飛虱ITIH4的功能進(jìn)行了研究,并對卵巢上皮栓的特異基因表達(dá)進(jìn)行了分析,研究結(jié)果如下:(1)克隆得到褐飛虱ITIH4基因,其開放閱讀框全長2724bp,翻譯907個(gè)氨基酸,等電點(diǎn)6.17,經(jīng)Signal P預(yù)測信號肽位點(diǎn)在第24位氨基酸處。通過序列比對和建立系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn),ITIH4在半翅目中保守。通過NCBI檢測到褐飛虱ITIH4轉(zhuǎn)錄出的蛋白質(zhì)序列有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域保守,分別是穹窿蛋白間α胰蛋白酶結(jié)構(gòu)域(Vault protein inter-alpha-trypsin domain,VIT)和馮維勒布蘭德因子A型(Von Willebrand factor type A,v WFA)結(jié)構(gòu)域。熒光定量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),褐飛虱ITIH4在若蟲2齡期之間表達(dá)量最高,4齡最低,在羽化后第二天的雌成蟲中顯著上調(diào)。ITIH4基因表達(dá)RNA干擾后,褐飛虱死亡率非常高,在羽化的第4天死亡率累積超過87%。實(shí)驗(yàn)組注射后10天平均產(chǎn)卵量為29.4枚,比對照組降低了57.3%,實(shí)驗(yàn)組卵孵化率為63.5%,低于對照組(87.7%)。被RNA干擾的褐飛虱卵巢發(fā)育較未被干擾的緩慢,卵黃蛋白前體——卵黃蛋白原(Vitellogenin,Vg)以及卵黃蛋白原受體(Vitellogenin Receptor,Vg R)的表達(dá)均下調(diào),說明ITIH4可能協(xié)調(diào)上述基因而影響褐飛虱生殖。結(jié)合產(chǎn)卵量與孵化率統(tǒng)計(jì),推測ITIH4的干擾會阻止Vg的形成和累積,從而影響褐飛虱卵的發(fā)育,甚至致死;昆蟲卵黃沉淀受保幼激素(juvenile hormone,JH)調(diào)控,保幼激素受體(Methoprene-tolerant,Met)在褐飛虱體內(nèi)介導(dǎo)保幼激素的行為。經(jīng)熒光定量PCR檢測保幼激素受體表達(dá)量,除注射第3天的試蟲外,并沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。KEGG通路分析顯示,調(diào)控Vg及卵巢發(fā)育的基因如胰島素生長因子IGF、轉(zhuǎn)化生長因子TGFB等與ITIH4在大分子的胞吞作用中可能存在共表達(dá)。綜上所述,ITIH4在褐飛虱生殖過程中對卵巢的發(fā)育和卵黃蛋白原的合成、累積起重要作用。(2)解剖獲得褐飛虱卵巢的卵巢小管柄(petiole)、上皮栓、卵泡(follicle)等3個(gè)組織的濾泡細(xì)胞,進(jìn)行Illumina轉(zhuǎn)錄組高通量測序,對上皮栓的特異表達(dá)基因進(jìn)行篩選和分析。本研究應(yīng)用高通量測序,獲得78427277條序列,平均長度517bp,經(jīng)Trinity法拼接組裝后將這些基因與公共數(shù)據(jù)庫(KEGG,KOG,Pfam,NR和SWISS-Prot)對比后,注釋了151422條基因。通過分析注釋數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)上皮栓處有關(guān)內(nèi)膜(endosome membrane)、胞吞作用(endocytosis)、細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合囊泡(cytoplasmic membrane-bounded vesicle)的基因表達(dá)顯著高于卵泡和卵巢小管柄,推測這些基因可能是有關(guān)YLS侵入卵巢部位有關(guān)。其中DNAJC1、TGFBR1等蛋白與ITIH4可能存在互作。
【圖文】：

圖 1.1 卵巢小管結(jié)構(gòu)圖[17]G：gonad 生殖腺，V：vitellariuYLS: yeast-like symbionts 類酵母發(fā)育情況，可將褐飛虱卵巢V 級，參表 1.1。1.1 褐飛虱卵巢發(fā)育情況分級卵巢主要形態(tài)相粘粘，小管的生殖區(qū)和小管本部漸延伸，，卵黃腺的長度明顯比生殖側(cè)輸卵管中央縊縮，連接到卵巢小續(xù)長大，卵巢小管柄(ovariole ped

圖 2.1 褐飛虱 RNA 電泳泳道 M 為 DL2000 DNA Marker，泳道 1-5 為 1-5 齡若蟲 RNA，泳道 6-10 為 1-5雌成蟲 RNA，泳道 11-15 為 1-5 日齡短翅雌成蟲 RNA。.2 褐飛虱 ITIH4基因的擴(kuò)增在 pMD-19T 載體上的克隆位點(diǎn)是 BcaBEST Sequencing Primer M13-4-M 結(jié)合位點(diǎn)�；蚱慰截悢�(shù)相關(guān)的公式為：拷貝數(shù)(copies/mL)=6.02×1023×濃度(g/ML)÷[目的片段大小(b0(dalton/bp)]在本實(shí)驗(yàn)中，預(yù)測的目的片段大小約為 3000bp，測得濃度 54.3ng/μL 式，得到拷貝數(shù) 1.65×1014拷貝每毫升。轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌后擴(kuò)繁，板涂布，挑取單克隆，菌液 PCR 后進(jìn)行電泳，條帶大小符合預(yù)期（如圖 2克隆菌株送交上海桑尼生物科技有限公司對目的片段進(jìn)行測序。
【學(xué)位授予單位】：中國計(jì)量大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S435.112.3

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本文編號：2671712