【摘要】：2003年,國(guó)際上首次從荷蘭的桃蚜(Myzus persicae)分離獲得桃蚜濃核病毒并測(cè)定了該病毒的部分基因組序列。目前,關(guān)于桃蚜濃核病毒的進(jìn)化關(guān)系與侵染分子機(jī)理所知甚少。在早先獲得桃蚜濃核病毒楊凌株系(MpDV-YL)基因組編碼序列的基礎(chǔ)上,我們又?jǐn)U增獲得了桃蚜濃核病毒云南株系的基因組編碼序列(MpDV-YN),并分析了其序列特征及桃蚜濃核病毒進(jìn)化關(guān)系。此外,我們檢測(cè)了桃蚜濃核病毒在桃蚜及桃蚜寄主植物中的表達(dá)和復(fù)制情況,研究結(jié)果如下:1、根據(jù)已獲得的MpDV-YL基因組序列設(shè)計(jì)重疊PCR引物。采用PCR從采自云南省昆明地區(qū)的桃蚜中擴(kuò)增獲得大小為5483bp的桃蚜濃核病毒片段。序列分析表明,該基因組與MpDV-YL基因組編碼策略一致,即正義鏈含有兩個(gè)ORF(ORF1和ORF2),預(yù)測(cè)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2,而反義鏈含有兩個(gè)ORF(ORF3和ORF4),預(yù)測(cè)編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2,該結(jié)果進(jìn)一步顯示中國(guó)國(guó)內(nèi)的桃蚜濃核病毒與桃蚜濃核病毒荷蘭株系的編碼策略不同;2、采用定量PCR檢測(cè)MpDV-YL在桃蚜幼蟲(chóng)的頭部、腸道、胚胎及表皮組織中的復(fù)制。結(jié)果表明,桃蚜濃核病毒在蚜蟲(chóng)腸道內(nèi)的拷貝數(shù)極顯著高于在其它組織中,揭示該病毒主要在蚜蟲(chóng)的腸道內(nèi)復(fù)制;3、采用定量PCR檢測(cè)MpDV-YL預(yù)測(cè)的NS1、NS2、VP1、VP2編碼基因在蚜蟲(chóng)體內(nèi)及幼蚜頭部、腸道、胚胎及表皮組織中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明,VP1編碼基因在蚜蟲(chóng)體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于其它基因的表達(dá)水平;同時(shí),各基因均在蚜蟲(chóng)腸道內(nèi)存在較高的轉(zhuǎn)錄水平;4、為了檢測(cè)桃蚜濃核病毒能否在桃蚜寄主植物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn),我們檢測(cè)了感染MpDV-YL桃蚜取食寄主(辣椒和甘藍(lán))后這兩種植物葉片、莖、根中MpDV-YL的復(fù)制情況。定量PCR結(jié)果顯示,MpDV-YL在兩種植物葉片中的基因組拷貝數(shù)顯著高于其它組織;進(jìn)一步分析表明,經(jīng)DNase I處理后,兩種植物葉片中MpDV-YL含量極顯著降低,推測(cè)在桃蚜寄主植物葉片中存在的MpDV-YL可能來(lái)源于葉片表面蚜蟲(chóng)蜜露的污染;5、構(gòu)建了的MpDV-YL VP1和VP2基因的瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾Sf9細(xì)胞。雙分子熒光互補(bǔ)(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)檢測(cè)結(jié)果表明VP1與VP2之間可能不存在相互作用;隨后,構(gòu)建了6×His融合的VP1和VP2瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明,VP1和VP2在Sf9細(xì)胞中都表達(dá)了預(yù)期大小的蛋白,推測(cè)這兩個(gè)蛋白未發(fā)生剪切。綜上所述,國(guó)內(nèi)存在的桃蚜濃核病毒基因組編碼策略可能與已發(fā)現(xiàn)的桃蚜濃核病毒荷蘭株系存在較大差異,而該類病毒在無(wú)脊柱動(dòng)物細(xì)小病毒的進(jìn)化中可能單獨(dú)作為一個(gè)分支。桃蚜濃核病毒主要在蚜蟲(chóng)腸道內(nèi)復(fù)制,該類病毒可能不能通過(guò)蚜蟲(chóng)取食而進(jìn)入桃蚜植物組織并發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)。上述結(jié)果為進(jìn)一步研究桃蚜濃核病毒侵染機(jī)理奠定了一定基礎(chǔ)。
【圖文】：

包括 5 個(gè) ORF，位于正義鏈的 5’-端的 3 個(gè) ORF 分NS2（225 aa）、NS3（698 aa），，位于反義鏈 5’-端的 2 個(gè) ORF 可編分別為 57 kDa、64 kDa、68 kDa、85 kDa、92 kDa（圖 1-1）（Va。年，本實(shí)驗(yàn)室在陜西省楊凌地區(qū)的桃蚜中檢測(cè)到了一種桃蚜濃核病毒楊凌株系，MpDV-YL），并對(duì)其基因組進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)為 5483 個(gè)堿基，位于基因組正義鏈 5’-端的兩個(gè) ORF 分別編碼 3蛋白；反義連 5’-端的兩個(gè) ORF 分別編碼大小為 193 aa 和 721 aa 的DV-YL 的桃蚜接種于 7 葉期的辣椒葉片上，結(jié)果在辣椒根、以及莖中均未檢測(cè)到桃蚜濃核病毒，初步表明 MpDV-YL 在桃蚜寄主（王哲，2016）。MpDV-NL 感染蚜蟲(chóng)后可導(dǎo)致蚜蟲(chóng)的發(fā)育歷期延長(zhǎng)、體重減輕、繁et al. 2009; van Munster et al. 2003a）。

圖 1-2 MpnDV 基因組結(jié)構(gòu)示意圖（Song et al. 2016）Fig. 1-2 Schematic presentation of the genomic organization of MpnDV白框，表示外顯子；黑框，表示內(nèi)含子粉紅裂蚜濃核病毒（DplDV）紅裂蚜濃核病毒（DplDV），基因組由 4979 個(gè)堿基組成（GenBank ac1），病毒粒徑為 22 nm，包含 4 個(gè) ORF，其中，正義鏈 5’-端的 2 個(gè)（710 aa）和 NS2（414 aa），而反義鏈則可能含有兩個(gè) ORF 編碼 VPabov et al. 2009）。V 感染后導(dǎo)致蚜蟲(chóng)繁殖率顯著降低，且誘導(dǎo)有翅蚜產(chǎn)生，促進(jìn)寄主更物，有利于蚜蟲(chóng)種群擴(kuò)散；值得注意的是，感染 DplDV 的蚜蟲(chóng)可以感病若蚜，這使得在新植物定植后能夠產(chǎn)生無(wú)病毒繁殖系。（Ryabov ter et al. 2003a）。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S476.13

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本文編號(hào)：2671353