【摘要】：黃單胞菌屬是最為重要的植物病原細菌屬之一,能夠危害多種重要的糧食及經(jīng)濟作物,其中有14種為我國檢疫性有害生物。由于屬內(nèi)成員數(shù)目眾多,種下又分為許多致病變種,致使該屬種及種下階元的鑒定存在很大困難。DNA條形碼技術(shù)是一種利用特定的DNA序列來鑒定物種的分子生物學(xué)技術(shù),具有準(zhǔn)確、快速、高通量等優(yōu)點,可以很好地滿足口岸檢疫及植保機構(gòu)的工作需求。因此,為了提高在種及種下階元上準(zhǔn)確鑒定黃單胞菌的能力,本研究開展了黃單胞菌屬DNA條形碼技術(shù)研究;同時為了提高該屬內(nèi)一些重要致病變種的精準(zhǔn)鑒定能力,我們還針對其開展了數(shù)字PCR檢測方法研究。(1)黃單胞菌屬DNA條形碼基因篩選以327株不同種或致病變種的黃單胞菌為實驗材料,基于進化樹法及遺傳距離法等分別對16S rRNA基因,cpn60,avrBs2,hrp,hpaA,gyrB和rpoD這7個候選條形碼基因進行了篩選驗證及有效性評價。研究結(jié)果表明cpn60基因的PCR擴增與測序成功率都要明顯優(yōu)于其他候選基因。基于其構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹也顯示該基因?qū)S單胞菌屬種及種下階元的區(qū)分鑒定能力最為理想。同時在barcoding gap分析和best close match測試中該基因也都表現(xiàn)的最為出色,其種/致病變種間遺傳距離明顯大于種/致病變種內(nèi)遺傳距離,而且對不同種/致病變種的鑒定正確率達到了99%以上,是理想的用于區(qū)分鑒定黃單胞菌的條形碼基因。(2)黃單胞菌屬DNA條形碼檢測體系的建立及應(yīng)用基于篩選出的DNA條形碼基因及研究獲得的大量序列數(shù)據(jù),建立了黃單胞菌屬DNA條形碼檢測技術(shù)體系。同時利用該體系和多種傳統(tǒng)鑒定方法對收集到的疑似黃單胞菌分離物及病害樣品進行了應(yīng)用驗證與比較分析,結(jié)果顯示多種檢測方法得到的結(jié)果均保持一致,但相比之下,DNA條形碼檢測方法的鑒定結(jié)果準(zhǔn)確度更高,操作過程也更為簡便快速,易于推廣。(3)黃單胞菌屬重要致病變種檢測技術(shù)研究以水稻細菌性條斑病菌、水稻白葉枯病菌以及它們的近緣菌為研究對象,分別基于細菌性條斑病菌的假定膜蛋白基因和白葉枯病菌的rhs家族基因建立了這兩種病原菌的特異性數(shù)字PCR檢測體系。對方法的特異性、靈敏度及重復(fù)性進行了測試,并用模擬帶菌水稻種子及真實種子樣品進行了檢測驗證。結(jié)果表明,所建立的兩種方法均能特異性的檢測出目標(biāo)菌株,且均具有較高的靈敏度及良好的重復(fù)性,在模擬帶菌種子及自然帶菌種子樣品的應(yīng)用驗證中也都得到了滿意的結(jié)果�？傊�,本研究為黃單胞菌屬種及種下階元的準(zhǔn)確鑒定提供了新的可靠的分子識別方法,對提高該屬有害生物的鑒定能力,保護國內(nèi)農(nóng)業(yè)和生態(tài)安全具有重要的意義。
【圖文】：

基于hpaA基因網(wǎng)上序列構(gòu)建的鄰接樹

（5'-3'） PCR 擴增程序 GGTTTTCCCAGTCACGACGACGGTGACGGCACCACCAC94°C 5 min；94°C 30 s57°C 30 s，72°C 45 s，，個循環(huán)；72°C 10 minATAACAATTTCACACAGGACGACCGAAGCCCGGGGCCTTGGTTTTCCCAGTCACGACGGACTGCCGGTGTTGATGCACGA94°C 2 min；94°C 1 mi60°C 1 min，72°C 1 mi35 個循環(huán)；72°C 7 minATAACAATTTCACACAGGACCGCGGTGATCGGTCAACAGGCTTTCGGTTTTCCCAGTCACGACTCCTCCTGTTGT94°C 5 min；94°C 40 s55°C 40 s，72°C 1 min35 個循環(huán)；72°C 10 mATAACAATTTCACACAGGAGATCATTTCTCCCGGTTTTCCCAGTCACGACGGATGACGACGA94°C 5 min；94°C 30 s55°C 30 s，72°C 1 min35 個循環(huán)；72°C 10 mATAACAATTTCACACAGGATGCGTCCTGAGC00 bp
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S432.42

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本文編號：2671884