【摘要】：斑翅果蠅[Drosopphila suzukii(Matsumura,1931)]是一種廣食性果實(shí)害蟲,已知寄主遍及18個(gè)科60多種水果。其危害是雌蟲將卵產(chǎn)于成熟和即將成熟的櫻桃、藍(lán)莓、草莓、柿子等軟皮果實(shí)里,幼蟲在果實(shí)內(nèi)部取食,嚴(yán)重?fù)p害水果品質(zhì)。斑翅果蠅生命活動(dòng)中需要完成的覓食,求偶,產(chǎn)卵等行為均離不開嗅覺系統(tǒng)的參與,而Orco受體能將傳統(tǒng)氣味受體運(yùn)送到嗅覺神經(jīng)元樹突膜的表面,并維持其構(gòu)象穩(wěn)定。研究斑翅果蠅Orco受體的表達(dá)方式和功能對(duì)從嗅覺系統(tǒng)發(fā)展新的害蟲治理策略具有重要意義。本文運(yùn)用PCR和RACE技術(shù)克隆了斑翅果蠅的Orco基因,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析;之后運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了斑翅果蠅各時(shí)期和不同組織的表達(dá)量;在此基礎(chǔ)上運(yùn)用RNA干擾技術(shù)鑒定了斑翅果蠅Orco基因的功能。主要研究結(jié)果如下:1.克隆得到的斑翅果蠅Orco基因mRNA序列長為1461 bp與NCBI(登錄號(hào):NM_001328601)查詢到的基本一致,生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示該基因編碼486個(gè)氨基酸,分子量大小為54271.14 Da,等電點(diǎn)為8.69;該蛋白亞細(xì)胞分布主要可能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng);有七段跨膜結(jié)構(gòu),該基因在氨基酸序列中不存在剪切位點(diǎn);該蛋白屬于疏水蛋白,但不屬于分泌蛋白。蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn),斑翅果蠅Orco基因第70-476位氨基酸殘基有一個(gè)Pfam 7tm_6的結(jié)構(gòu)域;該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α螺旋為主,主要由α螺旋和無規(guī)卷曲纏繞折疊形成三級(jí)結(jié)構(gòu)。2.采用qPCR方法對(duì)斑翅果蠅成蟲不同組織和不同發(fā)育時(shí)期進(jìn)行表達(dá)量分析。結(jié)果顯示,斑翅果蠅Orco在觸角中大量表達(dá),并且雄蟲表達(dá)量高于雌蟲;此外,在足、腹部和產(chǎn)卵器中Orco也有少量的表達(dá)。不同發(fā)育時(shí)期分析結(jié)果表明,斑翅果蠅Orco在卵、3齡幼蟲、蛹和成蟲中均有表達(dá),但成蟲期表達(dá)量要顯著高于其他時(shí)期,是卵期表達(dá)量的12倍。3.采用顯微注射法將dsRNA導(dǎo)入到羽化24 h后的斑翅果蠅腹部,干擾12 h、24 h和36 h后,用熒光定量PCR檢測(cè)斑翅果蠅Orco表達(dá)情況。結(jié)果顯示干擾12 h到24 h時(shí),表達(dá)量發(fā)生顯著性降低,說明dsRNA沉默了斑翅果蠅Orco基因的表達(dá),此外,化學(xué)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)也表明此時(shí)斑翅果蠅的尋找食物源的能力大大降低,說明對(duì)其搜尋寄主有影響,證明這個(gè)基因是與斑翅果蠅嗅覺相關(guān)的,沉默會(huì)損害斑翅果蠅的嗅覺能力。
【圖文】：

１．８－２．０之間，ＯＤ邋２６０／２３０值在２．０－２．５之間，說明提取的ＲＮＡ純度較高，儀逡逑器自動(dòng)計(jì)算出ＲＮＡ濃度。�。蛾�(duì)經(jīng)糖凝膠電泳后，利用ＳｅｎｓｉＣａｐｔｕｅｒ軟件對(duì)圖逡逑像進(jìn)行懫集分析。結(jié)果如圖２－１：逡逑２０逡逑

？＝■逡逑Ｍ：ｍａｒｋｅｒ，，邋１：邋ＰＣＲ邋產(chǎn)物逡逑圖２．１總ＲＮＡ電泳圖譜逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ邋ｏｆ邋ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ逡逑３．邋２斑翅果４１邋Ｏｒｅｏ基因全長序列拼接逡逑克隆得到的ｃＤＮＡ全長序列為１８１２邋ｂｐ，開放閱讀框從１１邋ｂｐ－１４７１邋ｂｐ，起逡逑始密碼子ＡＴＧ與終止密碼子ＴＧＡ邋（下劃線表示）之間的堿基長度為１４６１邋ｂｐ。逡逑經(jīng)上海伯尚生物科技有限公司拼接得到全長序列如下：逡逑ＡＡＴＡＧＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＡＡＣＣＴＣＧＡＴＧＣＡＧＣＣＧＡＧＣＡＡＧＴＡＴＡＣＧＧＧＣＣ逡逑ＴＧＧＴＧＧＣＣＧＡＣＣＴＧＡＴＧＣＣＣＡＡＴＡＴＴＣＧＧＧＣＧＡＴＧＡＡＧＴＡＣＴＣＧＧＧＣＣＴＧ逡逑ＴＴＴＡＴＧＣＡＣＡＡＣＴＴＣＡＣＧＧＧＣＧＧＣＡＧＴＧＣＧＴＴＣＡＴＧＡＡＧＡＡＧＧＴＣＴＡＣＴＣ逡逑ＣＴＣＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＧＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＣＡＧＴＴＣＧＣＣＴＴＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＡＡ逡逑ＣＡＴＧＧＣＣＣＴＣＡＡＣＧＣＣＧＡＧＧＡＧＧＴＧＡＡＣＧＡＧＣＴＧＴＣＧＧＧＣＡＡＣＡＣＧＡＴＣＡ逡逑ＣＣＡＣＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＡＣＣＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＡＴＴＴＧＧＣＣＧＴＣＡ逡逑ＡＣＣＡＧＡＡＧＡＡＴＴＴＣＴＡＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧ
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S433

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1 向候君;斑翅果蠅非典型嗅覺受體Oreo的克隆、表達(dá)與功能鑒定[D];福建農(nóng)林大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2662813