【摘要】：核桃(Juglans regia L.)是重要的干果樹種,隨著核桃栽培面積的快速增加,由膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的核桃炭疽病(anthracnose)嚴(yán)重發(fā)生,導(dǎo)致果實壞疽脫落,造成核桃產(chǎn)量和品質(zhì)的重大損失,同時危害嫩梢和葉片,造成樹體衰弱甚至死亡,是目前核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的災(zāi)難性病害。WRKY是植物中一類非常重要的轉(zhuǎn)錄因子,參與植物抗病反應(yīng)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本實驗以抗病品種‘瑞嘉’為材料,克隆核桃JrWRKY4和JrWRKY21,研究了其對膠孢炭疽菌侵染的響應(yīng)。主要結(jié)果如下:1、從PlantTFDB 4.0數(shù)據(jù)庫下載核桃WRKY轉(zhuǎn)錄因子,篩選了71個核桃WRKY轉(zhuǎn)錄因子,并通過Ex PASy Proteomics Server在線軟件預(yù)測了核桃WRKY的等電點、分子量等。MEGA 5.0軟件對核桃WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,參考擬南芥(Arabidopsis thaliana)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的分類,將核桃WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為III類(I、II、III):第I類含有13個WRKY轉(zhuǎn)錄因子,每個轉(zhuǎn)錄因子都含有2個WRKY保守結(jié)構(gòu)域;第II類含有49個WRKY轉(zhuǎn)錄因子,第II類又可細(xì)分為IIa、IIb、IIc、IId和IIe 5個亞類,其中IIa亞類有5個,IIb亞類有8個,IIc亞類有16個,IId亞類有12個,IIe亞類有8個;第III類由9個WRKY轉(zhuǎn)錄因子組成。2、以抗病核桃品種‘瑞嘉’為材料,設(shè)計引物克隆了核桃JrWRKY4(GM519616)和JrWRKY21(GM519618.1)轉(zhuǎn)錄因子。JrWRKY4開放閱讀框全長1554 bp,編碼517個氨基酸,含有兩個WRKY保守結(jié)構(gòu)域,鋅指結(jié)構(gòu)為C_2H_2型,與櫻桃(Prunus avium)WRKY4(AGW17296.1)同源性達(dá)71.16%,屬于WRKY家族的第I類;JrWRKY21開放閱讀框全長1035 bp,編碼344個氨基酸,含有一個WRKY保守結(jié)構(gòu)域,鋅指結(jié)構(gòu)為C_2H_2型,與櫻桃WRKY21(XP 021821911.1)同源性達(dá)82.02%,屬于WRKY家族的II d亞類。3、實時熒光定量PCR檢測了核桃不同組織器官中JrWRKY4和JrWRKY21的表達(dá)情況。結(jié)果表明,JrWRKY4和JrWRKY21在不同組織中均有表達(dá),但不同組織之間存在明顯的差異。JrWRKY4和JrWRKY21均在成熟葉片中表達(dá)量最高。4、利用膠孢炭疽菌孢子液侵染核桃葉片,檢測了侵染0、3、6、12、24、48、72h后JrWRKY4和JrWRKY21的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),JrWRKY4和JrWRKY21表達(dá)量的變化趨勢是一致的,在6 h表達(dá)量達(dá)到最高值,JrWRKY4在6 h達(dá)到了初始的28倍,JrWRKY21達(dá)到了63倍。隨后表達(dá)量開始下降,并低于對照。這表明JrWRKY4和JrWRKY21可能參與核桃炭疽病脅迫的早期響應(yīng)。5、分別構(gòu)建了pPZP211-JrWRKY4-GFP和pPZP211-JrWRKY21-GFP植物融合表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法瞬時表達(dá)本生煙(Nicotiana benthamiana)葉片,于雙光子激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行定位觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)JrWRKY4和JrWRKY21蛋白均定位于細(xì)胞核中。6、在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中異源轉(zhuǎn)化核桃JrWRKY4和JrWRKY21,對轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行炭疽病抗性鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在膠孢炭疽菌侵染后,超表達(dá)JrWRKY4和JrWRKY21的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系與野生型相比,炭疽病發(fā)病的時間較晚,同時期癥狀較輕。JrWRKY4和JrWRKY21均可顯著增強(qiáng)擬南芥對膠胞炭疽菌的抗性。
【圖文】：

圖 1 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域（引自 Rushton，，2010）Fig.1 WRKY transcription factor conserved domains1.1.2 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化

8圖 2 核桃炭疽病不同部位發(fā)病癥狀（引自曲文文，2011）A：果實發(fā)病癥狀；B：葉片發(fā)病癥狀；C：枝干發(fā)病癥狀Fig.2 Symptoms of anthracnose in different organs of walnutA: Symptom on fruit; B: Symptom on leaves; C: Symptom on branc
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S436.64

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李俊杰;韓璐璐;馬燕;姚汪勁松;國靜;郭先鋒;;芍藥轉(zhuǎn)錄因子PlWRKY40的克隆及表達(dá)分析[J];植物生理學(xué)報;2017年04期

2 王國東;陳朝銀;李金晶;普麗梅;關(guān)瑞攀;葛鋒;劉迪秋;;漾濞大泡核桃JsWRKY1過表達(dá)增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草對膠孢炭疽菌的抗性[J];華北農(nóng)學(xué)報;2016年03期

3 谷彥冰;冀志蕊;遲福梅;喬壯;徐成楠;張俊祥;董慶龍;周宗山;;蘋果WRKY基因家族生物信息學(xué)及表達(dá)分析[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年16期

4 許媛;李鈴仙;于秀梅;劉大群;;F-box蛋白在植物抗逆境脅迫中的功能[J];植物生理學(xué)報;2015年07期

5 韓彥林;;核桃炭疽病和核桃舉肢蛾的發(fā)生與防治[J];河北果樹;2014年03期

6 寧安忠;;核桃炭疽病的綜合防治技術(shù)[J];落葉果樹;2014年03期

7 安海山;楊克強(qiáng);;核桃NBS類抗病基因類似物的序列特征及其與炭疽病的抗性[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年02期

8 劉霞;楊克強(qiáng);朱玉鳳;尹燕飛;;8種殺菌劑對核桃炭疽病病原菌膠孢炭疽菌的室內(nèi)毒力[J];農(nóng)藥學(xué)學(xué)報;2013年04期

9 許瑞瑞;張世忠;曹慧;束懷瑞;;蘋果WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因生物信息學(xué)分析[J];園藝學(xué)報;2012年10期

10 李欽存;;豫北核桃炭疽病發(fā)生規(guī)律及防治方法[J];特種經(jīng)濟(jì)動植物;2012年06期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 高秀梅;危害核桃的膠孢炭疽菌對核桃組織侵染過程的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

2 陳敏;桃樹WRKY轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)及休眠進(jìn)程中表達(dá)分析[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

本文編號：2662625