【摘要】：核桃(Juglans regia L.)是重要的干果樹種,隨著核桃栽培面積的快速增加,由膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的核桃炭疽病(anthracnose)嚴重發(fā)生,導致果實壞疽脫落,造成核桃產量和品質的重大損失,同時危害嫩梢和葉片,造成樹體衰弱甚至死亡,是目前核桃產業(yè)發(fā)展的災難性病害。WRKY是植物中一類非常重要的轉錄因子,參與植物抗病反應及其信號轉導途徑。本實驗以抗病品種‘瑞嘉’為材料,克隆核桃JrWRKY4和JrWRKY21,研究了其對膠孢炭疽菌侵染的響應。主要結果如下:1、從PlantTFDB 4.0數據庫下載核桃WRKY轉錄因子,篩選了71個核桃WRKY轉錄因子,并通過Ex PASy Proteomics Server在線軟件預測了核桃WRKY的等電點、分子量等。MEGA 5.0軟件對核桃WRKY轉錄因子家族進行系統(tǒng)進化分析,參考擬南芥(Arabidopsis thaliana)WRKY轉錄因子家族的分類,將核桃WRKY轉錄因子分為III類(I、II、III):第I類含有13個WRKY轉錄因子,每個轉錄因子都含有2個WRKY保守結構域;第II類含有49個WRKY轉錄因子,第II類又可細分為IIa、IIb、IIc、IId和IIe 5個亞類,其中IIa亞類有5個,IIb亞類有8個,IIc亞類有16個,IId亞類有12個,IIe亞類有8個;第III類由9個WRKY轉錄因子組成。2、以抗病核桃品種‘瑞嘉’為材料,設計引物克隆了核桃JrWRKY4(GM519616)和JrWRKY21(GM519618.1)轉錄因子。JrWRKY4開放閱讀框全長1554 bp,編碼517個氨基酸,含有兩個WRKY保守結構域,鋅指結構為C_2H_2型,與櫻桃(Prunus avium)WRKY4(AGW17296.1)同源性達71.16%,屬于WRKY家族的第I類;JrWRKY21開放閱讀框全長1035 bp,編碼344個氨基酸,含有一個WRKY保守結構域,鋅指結構為C_2H_2型,與櫻桃WRKY21(XP 021821911.1)同源性達82.02%,屬于WRKY家族的II d亞類。3、實時熒光定量PCR檢測了核桃不同組織器官中JrWRKY4和JrWRKY21的表達情況。結果表明,JrWRKY4和JrWRKY21在不同組織中均有表達,但不同組織之間存在明顯的差異。JrWRKY4和JrWRKY21均在成熟葉片中表達量最高。4、利用膠孢炭疽菌孢子液侵染核桃葉片,檢測了侵染0、3、6、12、24、48、72h后JrWRKY4和JrWRKY21的表達變化。結果發(fā)現,JrWRKY4和JrWRKY21表達量的變化趨勢是一致的,在6 h表達量達到最高值,JrWRKY4在6 h達到了初始的28倍,JrWRKY21達到了63倍。隨后表達量開始下降,并低于對照。這表明JrWRKY4和JrWRKY21可能參與核桃炭疽病脅迫的早期響應。5、分別構建了pPZP211-JrWRKY4-GFP和pPZP211-JrWRKY21-GFP植物融合表達載體,通過農桿菌介導法瞬時表達本生煙(Nicotiana benthamiana)葉片,于雙光子激光共聚焦顯微鏡下進行定位觀察,結果發(fā)現JrWRKY4和JrWRKY21蛋白均定位于細胞核中。6、在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中異源轉化核桃JrWRKY4和JrWRKY21,對轉基因擬南芥進行炭疽病抗性鑒定。結果發(fā)現,在膠孢炭疽菌侵染后,超表達JrWRKY4和JrWRKY21的轉基因擬南芥株系與野生型相比,炭疽病發(fā)病的時間較晚,同時期癥狀較輕。JrWRKY4和JrWRKY21均可顯著增強擬南芥對膠胞炭疽菌的抗性。
【圖文】：

圖 1 WRKY 轉錄因子保守結構域（引自 Rushton，，2010）Fig.1 WRKY transcription factor conserved domains1.1.2 WRKY 轉錄因子的進化

8圖 2 核桃炭疽病不同部位發(fā)病癥狀（引自曲文文，2011）A：果實發(fā)病癥狀；B：葉片發(fā)病癥狀；C：枝干發(fā)病癥狀Fig.2 Symptoms of anthracnose in different organs of walnutA: Symptom on fruit; B: Symptom on leaves; C: Symptom on branc
【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S436.64

【參考文獻】

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本文編號：2662625