【摘要】：芳香化合物受體(Aryl hydrocarbon receptor,AhR)是胞質(zhì)中的一種配體結(jié)合型的轉(zhuǎn)錄因子,主要參與對(duì)有毒物質(zhì)的代謝反應(yīng),近幾年研究表明,轉(zhuǎn)錄因子AhR參與昆蟲對(duì)多種殺蟲劑抗藥性的形成。本實(shí)驗(yàn)以東亞飛蝗為實(shí)驗(yàn)材料,利用RNAi技術(shù),同時(shí)基于飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),探究飛蝗LmAhR的代謝解毒調(diào)控機(jī)制,為尋找防治害蟲新標(biāo)靶和新型殺蟲劑的研發(fā)提供新方法和新思路。本研究的主要內(nèi)容如下:1.干擾飛蝗芳香化合物受體(LmAhR)基因影響飛蝗對(duì)殺蟲劑的敏感性本研究首先克隆得到LmAhR基因的全長序列;并通過基本生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了序列分析及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征分析;通過RT-qPCR技術(shù)分析其在不同組織部位和不同發(fā)育齡期的表達(dá)模式;利用RNAi技術(shù)沉默LmAhR基因,檢測(cè)飛蝗對(duì)四種典型殺蟲劑的敏感性。結(jié)果表明:LmAhR cDNA全長為4,010 bp,由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成,編碼842個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量91.65 kDa,理論等電點(diǎn)為8.13,AhR蛋白從N端到C端主要由b-HLH結(jié)構(gòu)域、PAS蛋白結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域三部分組成的;系統(tǒng)發(fā)育分析表明,飛蝗LmAhR首先與鱗翅目昆蟲AhR聚為一支;沉默LmAhR基因后使飛蝗對(duì)毒死蜱的敏感性增加,表明轉(zhuǎn)錄因子AhR參與飛蝗對(duì)毒死蜱的代謝解毒功能。以上研究為闡明飛蝗LmAhR基因功能和東亞飛蝗的新防治方法提供了理論基礎(chǔ),同時(shí)也豐富了昆蟲抗藥性研究的內(nèi)容。2.飛蝗比較轉(zhuǎn)錄組分析進(jìn)一步探索飛蝗轉(zhuǎn)錄因子AhR代謝解毒機(jī)制,構(gòu)建了一種深度測(cè)序的飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。測(cè)序共得到46.66 GB Clean Data;通過組裝,共得到79429條Unigene,序列總長度為71930521bp,N50 Length為1,876 bp,Mean Length為90,560 bp;利用EDGE工具,參照≥2倍的差異,p≤0.05作為截?cái)嘀?選擇處理組和對(duì)照之間差異表達(dá)的基因,基于該標(biāo)準(zhǔn),212個(gè)基因顯示差異表達(dá),其中67個(gè)基因的表達(dá)下調(diào),而145個(gè)基因的表達(dá)上調(diào),基于研究目的,我們重點(diǎn)研究下調(diào)組基因,并進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行eggNOG功能注釋、聚類以及富集性分析;最后用RT-qPCR對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證,根據(jù)測(cè)序分析結(jié)果我們篩選出了一個(gè)典型的解毒酶基因LmGSTd7,因此推測(cè)LmAhR可能是通過影響LmGSTd7基因的表達(dá)參與飛蝗的代謝解毒作用。3.飛蝗LmGSTd7基因?qū)Χ舅莉绲拿舾行詸C(jī)制研究根據(jù)上述轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果,本章進(jìn)一步探索GSTD7解毒酶與四種殺蟲劑的代謝反應(yīng)。首先利用RT-qPCR技術(shù)分析LmAhR和LmGSTd7基因在不同組織部位和不同發(fā)育齡期的表達(dá)模式,結(jié)果表明飛蝗LmAhR和LmGSTd7基因在檢測(cè)的組織中均有表達(dá),LmGSTd7和LmAhR基因的組織表達(dá)譜相似,在大腦和血淋巴中的表達(dá)量相對(duì)較高;LmAhR基因在飛蝗一齡若蟲期的表達(dá)量最高,在飛蝗二齡至四齡若蟲期有較高的表達(dá),而LmGSTd7在飛蝗的卵期的表達(dá)量最高,在三齡和五齡若蟲期的表達(dá)量相對(duì)較高。利用RNAi技術(shù)沉默LmGSTd7基因,檢測(cè)飛蝗對(duì)不同殺蟲劑的敏感性,結(jié)果在四種殺蟲劑處理后,飛蝗對(duì)毒死蜱的敏感性顯著性增加,推測(cè)轉(zhuǎn)錄因子AhR參與LmGSTd7基因的表達(dá)從而介導(dǎo)飛蝗對(duì)毒死蜱的代謝作用。采用原核表達(dá)技術(shù),將LmGSTd7在BL21(DE3)中表達(dá),經(jīng)Ni-NTA親和蛋白純化后,成功獲得飛蝗GSTD7蛋白,為后續(xù)體外農(nóng)藥代謝實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

芳香化合物受體（AhR）信號(hào)通路調(diào)控飛蝗對(duì)毒死蜱敏感機(jī)制研究上述濃度。采用點(diǎn)滴法，參照上述 2.1.8 方法注射雙鏈，24 h 后于三齡若蟲腹部第二、三體節(jié)點(diǎn)滴 3 μL，24 h 后統(tǒng)計(jì)飛蝗的死亡率，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，對(duì)照組點(diǎn)滴丙酮，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置 5 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù) 11 頭三齡若蟲。2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.2.1 飛蝗 LmAhR 基因的克隆利用本課題組已有的東亞飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，，以 “Aryl hydrocarbon receptor”為關(guān)鍵詞搜索飛蝗轉(zhuǎn)錄組 Nr 注釋庫，獲得一條飛蝗 LmAhR 基因的待定全長序列，利用 RT-PCR 法獲得飛蝗 LmAhR 基因全長 cDNA 序列，全長 4,010 bp，其中開放閱讀框?yàn)?2,529 bp，5′端非編碼區(qū)長 130 bp，3′端非編碼區(qū)長 1,351 bp。由 11 個(gè)外顯子和 10 個(gè)內(nèi)含子組成。（如圖 2-1）

圖 2-2 LmAhR 的結(jié)構(gòu)域示意圖Fig.2-2 Schematic diagram of deduced domains of LmAhR殘基，HLH：螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域，PAS：PER-ARNT-SIM 結(jié)構(gòu)域，富含 H:富，P / S：富含脯氨酸/絲氨酸的區(qū)域。圖 2-3 飛蝗 LmAhR 蛋白 N-端的三維分子結(jié)構(gòu)
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S433.2;S482.3

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本文編號(hào)：2663010