【摘要】：芳香化合物受體(Aryl hydrocarbon receptor,AhR)是胞質中的一種配體結合型的轉錄因子,主要參與對有毒物質的代謝反應,近幾年研究表明,轉錄因子AhR參與昆蟲對多種殺蟲劑抗藥性的形成。本實驗以東亞飛蝗為實驗材料,利用RNAi技術,同時基于飛蝗轉錄組數(shù)據(jù),探究飛蝗LmAhR的代謝解毒調控機制,為尋找防治害蟲新標靶和新型殺蟲劑的研發(fā)提供新方法和新思路。本研究的主要內容如下:1.干擾飛蝗芳香化合物受體(LmAhR)基因影響飛蝗對殺蟲劑的敏感性本研究首先克隆得到LmAhR基因的全長序列;并通過基本生物信息學技術對其進行了序列分析及蛋白質的結構特征分析;通過RT-qPCR技術分析其在不同組織部位和不同發(fā)育齡期的表達模式;利用RNAi技術沉默LmAhR基因,檢測飛蝗對四種典型殺蟲劑的敏感性。結果表明:LmAhR cDNA全長為4,010 bp,由11個外顯子和10個內含子組成,編碼842個氨基酸,預測蛋白質分子量91.65 kDa,理論等電點為8.13,AhR蛋白從N端到C端主要由b-HLH結構域、PAS蛋白結構域和轉錄激活結構域三部分組成的;系統(tǒng)發(fā)育分析表明,飛蝗LmAhR首先與鱗翅目昆蟲AhR聚為一支;沉默LmAhR基因后使飛蝗對毒死蜱的敏感性增加,表明轉錄因子AhR參與飛蝗對毒死蜱的代謝解毒功能。以上研究為闡明飛蝗LmAhR基因功能和東亞飛蝗的新防治方法提供了理論基礎,同時也豐富了昆蟲抗藥性研究的內容。2.飛蝗比較轉錄組分析進一步探索飛蝗轉錄因子AhR代謝解毒機制,構建了一種深度測序的飛蝗轉錄組數(shù)據(jù)庫。測序共得到46.66 GB Clean Data;通過組裝,共得到79429條Unigene,序列總長度為71930521bp,N50 Length為1,876 bp,Mean Length為90,560 bp;利用EDGE工具,參照≥2倍的差異,p≤0.05作為截斷值,選擇處理組和對照之間差異表達的基因,基于該標準,212個基因顯示差異表達,其中67個基因的表達下調,而145個基因的表達上調,基于研究目的,我們重點研究下調組基因,并進一步對差異表達基因進行eggNOG功能注釋、聚類以及富集性分析;最后用RT-qPCR對轉錄組數(shù)據(jù)進行驗證,根據(jù)測序分析結果我們篩選出了一個典型的解毒酶基因LmGSTd7,因此推測LmAhR可能是通過影響LmGSTd7基因的表達參與飛蝗的代謝解毒作用。3.飛蝗LmGSTd7基因對毒死蜱的敏感性機制研究根據(jù)上述轉錄組分析結果,本章進一步探索GSTD7解毒酶與四種殺蟲劑的代謝反應。首先利用RT-qPCR技術分析LmAhR和LmGSTd7基因在不同組織部位和不同發(fā)育齡期的表達模式,結果表明飛蝗LmAhR和LmGSTd7基因在檢測的組織中均有表達,LmGSTd7和LmAhR基因的組織表達譜相似,在大腦和血淋巴中的表達量相對較高;LmAhR基因在飛蝗一齡若蟲期的表達量最高,在飛蝗二齡至四齡若蟲期有較高的表達,而LmGSTd7在飛蝗的卵期的表達量最高,在三齡和五齡若蟲期的表達量相對較高。利用RNAi技術沉默LmGSTd7基因,檢測飛蝗對不同殺蟲劑的敏感性,結果在四種殺蟲劑處理后,飛蝗對毒死蜱的敏感性顯著性增加,推測轉錄因子AhR參與LmGSTd7基因的表達從而介導飛蝗對毒死蜱的代謝作用。采用原核表達技術,將LmGSTd7在BL21(DE3)中表達,經Ni-NTA親和蛋白純化后,成功獲得飛蝗GSTD7蛋白,為后續(xù)體外農藥代謝實驗奠定基礎。
【圖文】：

芳香化合物受體（AhR）信號通路調控飛蝗對毒死蜱敏感機制研究上述濃度。采用點滴法，參照上述 2.1.8 方法注射雙鏈，24 h 后于三齡若蟲腹部第二、三體節(jié)點滴 3 μL，24 h 后統(tǒng)計飛蝗的死亡率，本實驗設置實驗組和對照組，對照組點滴丙酮，每個實驗組設置 5 個生物學重復，每個生物學重復 11 頭三齡若蟲。2.2 實驗結果2.2.1 飛蝗 LmAhR 基因的克隆利用本課題組已有的東亞飛蝗轉錄組數(shù)據(jù)庫，，以 “Aryl hydrocarbon receptor”為關鍵詞搜索飛蝗轉錄組 Nr 注釋庫，獲得一條飛蝗 LmAhR 基因的待定全長序列，利用 RT-PCR 法獲得飛蝗 LmAhR 基因全長 cDNA 序列，全長 4,010 bp，其中開放閱讀框為 2,529 bp，5′端非編碼區(qū)長 130 bp，3′端非編碼區(qū)長 1,351 bp。由 11 個外顯子和 10 個內含子組成。（如圖 2-1）

圖 2-2 LmAhR 的結構域示意圖Fig.2-2 Schematic diagram of deduced domains of LmAhR殘基，HLH：螺旋-環(huán)-螺旋結構域，PAS：PER-ARNT-SIM 結構域，富含 H:富，P / S：富含脯氨酸/絲氨酸的區(qū)域。圖 2-3 飛蝗 LmAhR 蛋白 N-端的三維分子結構
【學位授予單位】：山西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S433.2;S482.3

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本文編號：2663010