【摘要】：苜蓿盲蝽Adelphocoris lineolatus為半翅目盲蝽科昆蟲,是一種多食性農(nóng)業(yè)害蟲,主要為害紫花苜蓿,棉花和玉米等田間作物,其寄主范圍多達(dá)245種,對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失。目前對苜蓿盲蝽的防治主要依靠化學(xué)防治,但化學(xué)防治導(dǎo)致的抗藥性問題越來越突出,田間防治效果越來越差,防治成本越來越高。田間調(diào)查表明,苜蓿盲蝽具有明顯的趨化性,其嗅覺在田間寄主定位和尋找配偶具有重要作用。因此,針對苜蓿盲蝽的嗅覺識別機制展開研究,闡明其交配行為的調(diào)控機制,有利于通過對其交配行為的干擾和阻斷,達(dá)到田間綠色高效防治的目的。本文根據(jù)苜蓿盲蝽氣味受體表達(dá)譜數(shù)據(jù),選擇5個雄蟲觸角高表達(dá)的氣味受體作為候選性信息素受體,并進(jìn)行了深入研究。主要結(jié)果如下:1.功能探究:通過爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)候選性信息素受體,利用電壓鉗記錄苜蓿盲蝽5個氣味受體的功能。結(jié)果表明,Alin OR13僅識別苜蓿盲蝽主要性信息素組分之一丁酸-反-2-己烯酯,而Alin OR33除能識別丁酸-反-2-己烯酯外,還能識別三種次要組分:丁酸丁酯、丁酸己酯和己酸己酯,但細(xì)胞反應(yīng)均不強烈;另外3個氣味受體對性信息素組分均無反應(yīng)。2.進(jìn)化分析:搜集四種半翅目昆蟲豌豆蚜、荔枝椿象、綠盲蝽、苜蓿盲蝽和果蠅的氣味受體氨基酸序列,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹表明,本文中鑒定的苜蓿盲蝽性信息素受體Alin OR13和Alin OR33聚在同一枝,表明其功能相似,同時還存在一個有待功能驗證的Alin OR64。而來自其他昆蟲的ORs大多獨立聚成分枝,將進(jìn)化樹分成明顯的幾部分。3.表達(dá)定位分析:采用q RT-PCR檢測Alin OR33和Alin OR13在苜蓿盲蝽不同發(fā)育時期和不同交配狀態(tài)下的表達(dá)情況。結(jié)果表明,Alin OR33和Ain OR13在若蟲期隨著齡期的上升,表達(dá)量逐漸上升,到成蟲期羽化3天表達(dá)量達(dá)到最高。Alin OR33在羽化三天已交配雄蟲中表達(dá)量最高,而Alin OR13在羽化五天已交配雄蟲表達(dá)量最高。原位雜交表明Alin OR13與Alin OR33均主要在長毛形感器表達(dá),其他感器未檢測到熒光信號。4.干擾后的電生理學(xué)變化:利用RNAi手段實現(xiàn)Alin OR33的基因沉默,q RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)Alin OR33觸角表達(dá)量下降70%以上;隨后通過EAG檢測干擾后苜蓿盲蝽觸角對四種配體的電生理反應(yīng)。結(jié)果表明,基因沉默的苜蓿盲蝽雄蟲對四種配體化合物的電生理反應(yīng)與未沉默的雄蟲相比下降50%左右,與未沉默的雄蟲電生理反應(yīng)大小相比有顯著性差異。5.干擾后的行為學(xué)變化:通過Y形嗅覺儀研究苜蓿盲蝽Alin OR33通過RNAi沉默后的行為學(xué)變化。結(jié)果表明,基因沉默后的苜蓿盲蝽雄蟲相比未沉默的雄蟲對丁酸-反-2-己烯酯的識別能力顯著下降,不能有效識別和定位化學(xué)信息源,表明干擾Alin OR33對苜蓿盲蝽性信息素識別影響顯著。
【圖文】：

圖 2-1 五個候選性信息素受體的序列比對Fig.2-1 Sequence alignment of five candidate pheromone receptors2.2.2 苜蓿盲蝽候選性信息素受體基因的功能鑒定將候選性信息素受體分別與 AlinOrco 在爪蟾卵母細(xì)胞中共表達(dá)，利用雙電極電壓鉗分別記錄表達(dá)不同氣味受體的爪蟾卵母細(xì)胞對單個性信息素組分的反應(yīng)。2.2.2.1 AlinOR33 功能鑒定以濃度為 10-3M 的配體化合物刺激爪蟾卵母細(xì)胞，電壓鉗記錄結(jié)果表明，AlinOR33/Orco 對性信息素組分丁酸丁酯、己酸己酯、丁酸-反-2-己烯酯和丁酸己酯均有不同程度的反應(yīng)。其中對丁酸反-2-己烯酯反應(yīng)相對較大，超過 200nA，對其他性信息素組分的反應(yīng)均未超過 100nA，，氣味受體 OR33 對丁酸-反-2-己烯酯的反應(yīng)與對其他性信息素的反應(yīng)存在顯著差異。以其他非性信息素組分酯類化合物刺激表達(dá) AlinOR33 的卵母細(xì)胞未檢測到反應(yīng)信號。

15圖 2-2 苜蓿盲蝽氣味受體 AlinOR33 的功能鑒定Fig.2-2 Functional identification of odorant receptor AlinOR33/Orco in A. lineolatus達(dá) AlinOR33/Orco 的爪蟾卵母細(xì)胞對濃度為 10-3M 配一系列酯類體化合物的反應(yīng)電流；B AlinOR33 的氣味反應(yīng)譜（N=4）以及物的分子結(jié)構(gòu)。2.2.2 AlinOR13 功能研究以濃度為 10-3M 的上述性信息素組分刺激表達(dá) AlinOR13 的爪蟾卵母細(xì)胞，電壓鉗記錄明，AlinOR13/Orco 僅對性信息素主要組分丁酸-反-2-己烯酯有反應(yīng)，反應(yīng)電流約為 500nA他性信息素組分均無反應(yīng)。進(jìn)一步測試爪蟾卵母細(xì)胞對非性信息素酯類化合物的反應(yīng)，同測到反應(yīng)信號。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S433.3

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