【摘要】：太子參(Pseudostellariae heterophylla(Miq.)Pax et Hoffm)是一種藥食兩用的草本植物,近年來(lái),隨著太子參中藥用活性成分的開(kāi)發(fā)利用,以太子參為原料的保健品產(chǎn)品日益增多,極高的應(yīng)用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值使得其得到廣泛的關(guān)注,而真菌病害的暴發(fā)已經(jīng)嚴(yán)重影響太子參的產(chǎn)量及品質(zhì)。固定化微生物技術(shù)是一種易于控制生物濃度、保護(hù)菌種、減少菌種的流失的重要生物防治措施。本文從實(shí)驗(yàn)室已篩選獲得的枯草芽孢桿菌JK05對(duì)太子參葉斑病病原菌斑點(diǎn)葉點(diǎn)霉的拮抗作用出發(fā),研究了JK05代謝產(chǎn)生的拮抗活性物質(zhì),復(fù)合材料固定化JK05生防小球的制備工藝,以及固定化生防小球的施用對(duì)太子參品質(zhì)的影響等,研究結(jié)果對(duì)太子參葉斑病等真菌病害的防治具有重要意義。論文主要研究成果如下:(1)對(duì)枯草芽孢桿菌JK05的拮抗活性物質(zhì)進(jìn)行了純化和鑒定。初步確定枯草芽孢桿菌JK05的拮抗活性物質(zhì)為蛋白質(zhì)成分,采用硫酸銨沉淀法對(duì)胞外發(fā)酵液進(jìn)行沉淀,在硫酸銨飽和度為40~60%范圍之間沉淀析出的粗蛋白具有顯著的拮抗活性,粗蛋白的拮抗活性隨熱處理溫度的升高而降低,在30~80℃范圍內(nèi)變化不顯著(P0.05),當(dāng)溫度高于80℃時(shí),則顯著降低(P0.05),但依然具有較高的拮抗活性,即拮抗蛋白粗提物具有良好的熱穩(wěn)定性;粗蛋白的拮抗活性在pH過(guò)低(pH 4)或pH過(guò)高(pH 10)的條件下顯著降低(P0.05),pH 5~9范圍之間的酸堿處理對(duì)其影響不顯著(P0.05)。40~60%粗蛋白經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析和SepadexG-100凝膠層析,洗脫獲得1個(gè)蛋白組分,其在SDS-PAGE圖譜上顯示為單一條帶,且該純化蛋白經(jīng)對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果顯示具有顯著拮抗活性,將其編號(hào)為BSAP。經(jīng)LC-MS/MS分析,初步將枯草芽孢桿菌JK05的拮抗活性蛋白BSAP鑒定為二氫硫辛酰胺脫氫酶。傅里葉紅外光譜掃描顯示,拮抗活性蛋白BSAP由于C=O鍵在平面內(nèi)伸縮振動(dòng),在酰胺Ⅰ帶1631.028cm~(-1)處有特征吸收峰,屬于β-折疊結(jié)構(gòu);由于C—N鍵反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)和N—H鍵平面內(nèi)彎曲振動(dòng),在酰胺Ⅲ帶1296.915 cm~(-1)處有特征吸收峰,屬于α-螺旋結(jié)構(gòu)。(2)利用固定化微生物技術(shù)將枯草芽孢桿菌JK05包埋制備獲得太子參葉斑病生防小球。以生防小球的機(jī)械性能、傳質(zhì)性能以及拮抗活性為指標(biāo),確定了生防小球最佳的復(fù)合載體材料組合為9%聚乙烯醇、3%海藻酸鈉和2%活性炭,生防小球的最佳包埋芽孢濃度為2?10~8 cfu/mL。掃描電子顯微鏡(SEM)結(jié)果顯示,生防小球內(nèi)部孔隙豐富發(fā)達(dá),孔隙內(nèi)部聚集大量JK05,且菌體結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)飽滿。在15~24℃范圍內(nèi),生防小球的拮抗活性隨著溫度的升高而增強(qiáng),具有顯著性差異(P0.05),當(dāng)上升到24℃時(shí),小球的拮抗活性達(dá)到最大值45.75%,當(dāng)溫度達(dá)到27℃時(shí)則降低,但與24℃時(shí)相比差異不顯著(P0.05);pH 4~8之間,生防小球具有較好的拮抗活性。風(fēng)干生防小球在制備完成后的60 d內(nèi)其相對(duì)生物活性較穩(wěn)定,相對(duì)生物活性大于80%;保存時(shí)間延長(zhǎng)至120 d,生防小球的相對(duì)生物活性為60%以上。(3)以太子參主要化學(xué)成分的變化為指標(biāo),分析獲得了栽培過(guò)程中施用生防小球?qū)μ訁⑵焚|(zhì)的影響:太子參多糖含量顯著提高(P0.05),多糖含量在施加劑量為0.1 g/株時(shí)達(dá)到最大值12.49%;水分含量、皂苷含量和灰分含量無(wú)明顯變化(P0.05);施加生防小球會(huì)降低太子參內(nèi)Fe和Mn元素含量,對(duì)Mg、Rb、Co等3種元素含量無(wú)影響,能提高K、Ca、Zn、Cu等4中元素含量;揮發(fā)性成分種類(lèi)有所提高;氨基酸中僅蛋氨酸含量有所下降,其它各氨基酸與對(duì)照組基本一致。
【圖文】：

將微生物細(xì)胞固定達(dá)到固定化的目的；該固定化方法結(jié)合強(qiáng)穩(wěn)定性，，但反應(yīng)過(guò)程激烈，導(dǎo)致微生物活性大大降低且一般交其在實(shí)際應(yīng)用中較為少見(jiàn)[77]。Iype[78]等人通過(guò)環(huán)氧氯丙烷將定到無(wú)涂層氧化鐵納米顆粒上，根據(jù)此方法還固定了酶，如辣酶，不損害固定化蛋白質(zhì)的活性還提高了酶的穩(wěn)定性。是通過(guò)聚合作用或形成離子網(wǎng)絡(luò)將微生物細(xì)胞截留在多孔載空間中，凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在截留細(xì)胞的同時(shí)能讓底物滲入和細(xì)來(lái)；該固定化方法操作簡(jiǎn)單、成本低、反應(yīng)相對(duì)溫和且制備的強(qiáng)度高，是目前固定化微生物最常用的方法[79]。Hahn-H[80]等和釀酒酵母包埋固定在海藻酸鈣凝膠中生產(chǎn)乙醇，固定化生物的運(yùn)行過(guò)程中，產(chǎn)率沒(méi)有下降。

Fig. 2.1 Antagonistic activity of supernatant fraction and protein precipitation after precipitationwith ammonium sulfate從圖2.1可以看出，在粗蛋白作用下，病原菌菌落的生長(zhǎng)受到了明顯的抑制，而濾液上清部分未出現(xiàn)拮抗現(xiàn)象，即枯草芽孢桿菌 JK05 發(fā)酵液中的蛋白成分對(duì)供試病原菌斑點(diǎn)葉點(diǎn)霉具有顯著拮抗效果，因此初步判斷拮抗菌 JK05 的拮抗活性物質(zhì)為蛋白質(zhì)成分。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S435.675;TB33

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2661460