【摘要】：近年來,由于抗生素藥物的廣泛使用,使耐藥病原體發(fā)展極為迅速,加之新抗生素分子的批準(zhǔn)率的降低,導(dǎo)致了全世界的死亡率增加。因此,急需研究發(fā)現(xiàn)新的、不易引發(fā)耐藥性的抗菌物質(zhì)�？咕�(Antimicrobial peptides,AMPs)是生物體受到微生物感染,由自身免疫產(chǎn)生的一類多肽物質(zhì),能夠?qū)θ磉M(jìn)行自我防御,與靶向特定細(xì)胞內(nèi)酶或DNA相作用的常規(guī)抗生素相比,AMPs由于長度短,組成簡單,蛋白酶穩(wěn)定和膜靶向作用這一獨(dú)特的作用機(jī)制,物理且迅速地滲透并破壞細(xì)胞質(zhì)膜,導(dǎo)致難以修復(fù)的損傷,而不易產(chǎn)生耐藥性,且不會對哺乳動(dòng)物正常細(xì)胞造成傷害。因此,微生物產(chǎn)生抗性的幾率比抗生素低得多。這表明AMPs可以通過克服抗生素固有的缺點(diǎn)而被開發(fā)為新的治療解決方案。有研究報(bào)道從鞘翅目昆蟲白星花金龜幼蟲(Protaetia brevitarsis Lewis larvae)中提取并分離純化出了具有抗菌作用的物質(zhì),本實(shí)驗(yàn)室通過以其全基因組序列作為實(shí)驗(yàn)的序列資源,并與抗菌肽數(shù)據(jù)庫(APD3)收集的抗菌肽進(jìn)行比對,獲得天然AMPs作為模板,結(jié)合AMPs序列特征,個(gè)別模板使用氨基酸替代法,利用一系列生物信息學(xué)網(wǎng)站軟件,預(yù)測篩選獲得的候選小分子AMPs的可能性,并送公司進(jìn)行合成,所有AMPs純度達(dá)到95%以上,通過對模板肽的結(jié)構(gòu)分析,列舉了30條候選小分子AMPs,通過比較理化參數(shù),篩選出16條參數(shù)較優(yōu)的多肽作為候選肽序列,其中,最優(yōu)的抗菌肽為10號VFRLKKWIQKVI,所帶正電荷最高(+4),疏水殘基比率也相對較高,且不穩(wěn)定系數(shù)極低(-4.98),二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主;對小分子抗菌肽進(jìn)行一系列生物活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,通過瓊脂打孔法、微量液體稀釋法和菌落計(jì)數(shù)法測定設(shè)計(jì)的小分子多肽分別對5種菌(大腸桿菌、銅綠假單胞菌、蘇云金芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌)的抗菌活性、最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)、分析抗菌肽對菌生長的影響,并繪制時(shí)間-殺菌曲線,確定抗菌效果�；钚詫�(shí)驗(yàn)初篩顯示獲得了5條(4號IVHLLTKMTK、10號VFRLKKWIQKVI、12號KIYVLLRRQA、14號ANWKKVIR、15號STLHLVLRLR-NH_2)抗菌活性高的小分子AMPs,其中以10號VFRLKKWIQKVI抑菌效果為最優(yōu),不僅對兩種革蘭氏陰、陽性菌都具有良好抑菌效果而且對真菌中的白色念珠菌也具有明顯抑菌作用,其對大腸桿菌、銅綠假單胞菌的最低抑菌濃度均為16μg/mL,最低殺菌濃度均為32μg/mL,對蘇云金芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度分別為16μg/mL、32μg/mL,最低殺菌濃度分別為64μg/mL、128μg/mL,對白色念珠菌最低抑菌濃度為64μg/mL,最低殺菌濃度為128μg/mL;動(dòng)態(tài)抑菌實(shí)驗(yàn)顯示,1/4倍MIC的氨芐西林組在1 h以后,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌開始有生長的趨勢,相較之下,在1/4倍MIC的濃度下,發(fā)現(xiàn)各抗菌肽組在3 h以后,才陸續(xù)開始有生長的趨勢,說明抗菌肽處理組都能夠更好地延緩微生物的生長;時(shí)間-殺菌曲線顯示,在2倍MIC的抗菌肽處理后,五條抗菌肽在作用的一開始就立即進(jìn)行殺菌,菌落數(shù)顯著減少,隨著時(shí)間的增加,殺菌速度逐漸減弱,曲線呈平緩趨勢;鹽穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)顯示,在PBS中,相同濃度的多肽處理大腸桿菌、金黃色葡萄球菌,抗菌活性顯著降低;酶解穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)顯示,所有的抗菌肽在被胰蛋白酶處理1 min后,都大大降低了抑菌活性。這說明本研究所設(shè)計(jì)的五種抗菌肽都容易被胰蛋白酶分解,降低了原本的活性。本研究通過設(shè)計(jì)小分子AMPs,篩選獲得有抗菌活性的AMPs五條,其中存在一條對細(xì)菌、真菌均具有良好的抗菌活性,為新型多肽類抗菌物質(zhì)的設(shè)計(jì)與研究奠定良好基礎(chǔ)。
【圖文】：

世界衛(wèi)生組織已經(jīng)發(fā)布了一份“優(yōu)先病原體”清單，其中包幾乎沒有有效的治療方案[7]。預(yù)計(jì)至本世紀(jì)中葉，倘若再無全的死亡病例每年將超過 1000 萬次[8,9]，因此，急需研發(fā)一種品。microbial peptides，AMPs）是地球上幾乎所有的有機(jī)體，由生的一種天然非特異性免疫防御的物質(zhì)。例如當(dāng)昆蟲受到外）后需對全身進(jìn)行自我防御，主要于體內(nèi)的脂肪體（功能類最終分泌到血淋巴中來達(dá)到自身免疫效果。陽離子 AMPs 廣]。AMPs 的長度、結(jié)構(gòu)和氨基酸組成極不均勻，國內(nèi)外科學(xué)理化性質(zhì)及抗菌活性進(jìn)行深入研究與探索，最終證實(shí)一般的基，所有 AMPs 都具有相似的氨基酸組成，其特征在于具有氨基酸[11]，基于此結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)保證了 AMPs的諸多優(yōu)良特性。且病毒和抗真菌，不容易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，生物毒性低，，正電荷能夠與細(xì)菌膜表面負(fù)電荷間發(fā)生靜電吸附，其疏水組其膜結(jié)構(gòu)，最終使內(nèi)外滲透壓失衡死亡[13]（如圖 1-1 所示）合以及病原菌中多種抗生素抗性的傳播使得 AMPs 成為常規(guī)，它的開發(fā)為解決傳統(tǒng)抗生素耐藥性問題提供了一個(gè)新的方具有極其廣闊的前景。

a.桶板模型 b.地毯模型 c.環(huán)形孔模型 d.無序模型圖 1-3 膜作用通道示意圖[23]Fig.1-3 Membrane channel model模型3 中 a 所示，AMPs 首先附著于脂質(zhì)膜表面，其軸平行于脂質(zhì)膜表質(zhì)雙層的疏水核心對齊，導(dǎo)致形成永久性跨膜孔。肽的親水區(qū)構(gòu)此自組裝或相互作用以形成結(jié)構(gòu)排列，其看起來像空心圓柱體，桿菌肽 S 就是通過桶板模型發(fā)揮抑菌作用的[23]。模型提出 AMPs 的膜分解活性是由于膜脂質(zhì)變成小聚集體。如圖 1-3 中基團(tuán)作用形成一種地毯狀，并平行排列于膜表面，引起堆積的脂體，最終使膜結(jié)構(gòu)不完整，進(jìn)而胞內(nèi)物溢出。在抗菌活性期間沒征。高 P：L（肽與脂質(zhì)）比例的陽離子肽就是通過這種作用機(jī)制孔模型
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S433.5

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本文編號：2660817