【摘要】：從芒果的葉和莖的組織中分離并鑒定得到解淀粉芽孢桿菌MG-3,該菌株能夠分泌多種抑制果蔬病害真菌的活性物質(zhì)。本文對解淀粉芽孢桿菌MG-3分泌抗菌蛋白的分離純化及其性質(zhì)進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)將解淀粉芽孢桿菌MG-3培養(yǎng)得到發(fā)酵液,先采用硫酸銨分級沉淀法,按20%,40%,60%的硫酸銨飽和度分離濃縮粗蛋白,再采用DEAE-650C弱陰離子交換層析和Sephacry1 S-200凝膠層析的技術(shù)組合策略,分離純化粗蛋白。以枇杷焦腐病菌為供試菌株,驗(yàn)證抗菌蛋白的抗菌活性;并用SDS-PAGE電泳分析抗菌蛋白為單一組分,分子量大約45KDa。利用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定抗菌蛋白,結(jié)果表明抗菌蛋白很可能是絲氨酸蛋白酶,分子量大約48147.1Da。對純化到的抗菌蛋白進(jìn)行穩(wěn)定性研究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抗菌蛋白具有良好的穩(wěn)定活性,無論溫度,pH,紫外線等處理?xiàng)l件怎么變化,抗菌蛋白的相對活性都維持在70%以上。其中蛋白酶K對抗菌蛋白的活性幾乎沒有影響;抗菌蛋白100℃處理30min后,仍能保持70%相對活性。研究測定抗菌蛋白濃度對枇杷焦腐病抑制效果的影響,抗菌蛋白對病害菌的作用方式及抗菌蛋白的廣譜性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:半數(shù)抑菌濃度(IC50)是40.58ug/mL,最小抑菌率(MIC)是80.60ug/mL及最小殺菌率(MBC)是119.8ug/mL;抗菌蛋白不僅能夠降解病害真菌的菌絲,也能抑制病害菌的分生孢子的萌發(fā);抗菌蛋白能夠抑制枇杷焦腐病菌,枇杷炭疽病菌,橄欖焦腐病菌,荔枝焦腐病菌等多種果蔬病害真菌,具有良好的廣譜性;還能保護(hù)枇杷,延遲枇杷的存儲時(shí)間。根據(jù)抗菌蛋白的質(zhì)譜的鑒定結(jié)果和NCBI數(shù)據(jù)庫比對分析,設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)引物,以解淀粉芽孢桿菌MG-3的基因組作為模板,PCR擴(kuò)增目的片段基因,將目的片段基因與PMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌,測序。將含有目的片段基因的T載體與PET-28a的載體雙酶切,再將目的片段與酶切的PET-28a載體連接,構(gòu)建成表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。用IPTG誘導(dǎo)目的片段基因在大腸桿菌表達(dá),離心,破碎菌體,采用鎳柱層析法純化重組蛋白,同樣以枇杷焦腐病菌作為供試菌株,驗(yàn)證重組蛋白的抗菌活性。
【圖文】：

１．３．２．３疏水相互作用色譜逡逑疏水相互作用色譜是將混合物中的物質(zhì)用鹽類物質(zhì)，使其蛋白質(zhì)中的疏水基團(tuán)暴逡逑露出來，與疏水層析的非極性介質(zhì)結(jié)合的一種分離方法，見圖１－３。疏水層析是由逡逑丁１５“１１５［８６］于１９４８年發(fā)現(xiàn)的，通常用來分離不易用離子交換層析和凝膠交換層析純化逡逑的物質(zhì)。蛋白質(zhì)經(jīng)過高鹽濃度處理后，與疏水層析中固定相結(jié)合，，逐漸降低洗脫液中逡逑的鹽濃度，使蛋白質(zhì)發(fā)生可逆反應(yīng)，不再與疏水介質(zhì)結(jié)合，洗脫下來。因?yàn)檫@過程存逡逑在使蛋白質(zhì)活性受損的可能，只用在其他層析方法不能純化到目的蛋白的情況，才使逡逑用疏水層析。逡逑９逡逑

親和層析具有很強(qiáng)的專一性，純化程度高等特點(diǎn)。親和層析是根據(jù)層析介質(zhì)與蛋逡逑白質(zhì)之間的生物學(xué)活性，不是依據(jù)兩者之間的物化特性進(jìn)行分離。親和層析的配基與逡逑混合物中某一蛋白質(zhì)能夠特異性結(jié)合，而且可以可逆反應(yīng)，見圖１－４。一般使用于帶逡逑有標(biāo)簽的重組蛋白的純化或者抗原與抗體之間的分離純化。因?yàn)樵摲椒ň哂芯窒扌�，逡逑而且成本相對高，較少用于天然蛋白的純化。逡逑（１）邐（２）邐（３）逡逑｜Ａ邋＞Ｘ＾｜ＡＷａＳｈ＾逡逑ＪＣ邋Ｓａｍｐｌｅ邋Ｍ邋｜邋ｗｔ邋＾逡逑ｋｔ邋Ｌ邋＼ｍｂ邋＼：ｋ逡逑親和基團(tuán)＾邋ｉ邐＾逡逑ｆ配體＊７…ｒ逡逑Ａ■S緬澹ｅ澹ｅ澹ｅ危攏縢？逡逑載體逡逑圖１－４親和層析原理示意圖逡逑Ｆｉｇ．邋１－４邋Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ邋ｏｆ邋ａｆｆｉｎｉｔｙ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ逡逑１０逡逑
【學(xué)位授予單位】：福州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S476

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10 廖富

本文編號：2660005