【摘要】：從芒果的葉和莖的組織中分離并鑒定得到解淀粉芽孢桿菌MG-3,該菌株能夠分泌多種抑制果蔬病害真菌的活性物質(zhì)。本文對解淀粉芽孢桿菌MG-3分泌抗菌蛋白的分離純化及其性質(zhì)進行研究。本實驗將解淀粉芽孢桿菌MG-3培養(yǎng)得到發(fā)酵液,先采用硫酸銨分級沉淀法,按20%,40%,60%的硫酸銨飽和度分離濃縮粗蛋白,再采用DEAE-650C弱陰離子交換層析和Sephacry1 S-200凝膠層析的技術(shù)組合策略,分離純化粗蛋白。以枇杷焦腐病菌為供試菌株,驗證抗菌蛋白的抗菌活性;并用SDS-PAGE電泳分析抗菌蛋白為單一組分,分子量大約45KDa。利用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定抗菌蛋白,結(jié)果表明抗菌蛋白很可能是絲氨酸蛋白酶,分子量大約48147.1Da。對純化到的抗菌蛋白進行穩(wěn)定性研究,實驗結(jié)果表明抗菌蛋白具有良好的穩(wěn)定活性,無論溫度,pH,紫外線等處理條件怎么變化,抗菌蛋白的相對活性都維持在70%以上。其中蛋白酶K對抗菌蛋白的活性幾乎沒有影響;抗菌蛋白100℃處理30min后,仍能保持70%相對活性。研究測定抗菌蛋白濃度對枇杷焦腐病抑制效果的影響,抗菌蛋白對病害菌的作用方式及抗菌蛋白的廣譜性。實驗結(jié)果表明:半數(shù)抑菌濃度(IC50)是40.58ug/mL,最小抑菌率(MIC)是80.60ug/mL及最小殺菌率(MBC)是119.8ug/mL;抗菌蛋白不僅能夠降解病害真菌的菌絲,也能抑制病害菌的分生孢子的萌發(fā);抗菌蛋白能夠抑制枇杷焦腐病菌,枇杷炭疽病菌,橄欖焦腐病菌,荔枝焦腐病菌等多種果蔬病害真菌,具有良好的廣譜性;還能保護枇杷,延遲枇杷的存儲時間。根據(jù)抗菌蛋白的質(zhì)譜的鑒定結(jié)果和NCBI數(shù)據(jù)庫比對分析,設(shè)計帶有酶切位點引物,以解淀粉芽孢桿菌MG-3的基因組作為模板,PCR擴增目的片段基因,將目的片段基因與PMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌,測序。將含有目的片段基因的T載體與PET-28a的載體雙酶切,再將目的片段與酶切的PET-28a載體連接,構(gòu)建成表達載體,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。用IPTG誘導(dǎo)目的片段基因在大腸桿菌表達,離心,破碎菌體,采用鎳柱層析法純化重組蛋白,同樣以枇杷焦腐病菌作為供試菌株,驗證重組蛋白的抗菌活性。
【圖文】：

１．３．２．３疏水相互作用色譜逡逑疏水相互作用色譜是將混合物中的物質(zhì)用鹽類物質(zhì)，使其蛋白質(zhì)中的疏水基團暴逡逑露出來，與疏水層析的非極性介質(zhì)結(jié)合的一種分離方法，見圖１－３。疏水層析是由逡逑丁１５“１１５［８６］于１９４８年發(fā)現(xiàn)的，通常用來分離不易用離子交換層析和凝膠交換層析純化逡逑的物質(zhì)。蛋白質(zhì)經(jīng)過高鹽濃度處理后，與疏水層析中固定相結(jié)合，，逐漸降低洗脫液中逡逑的鹽濃度，使蛋白質(zhì)發(fā)生可逆反應(yīng)，不再與疏水介質(zhì)結(jié)合，洗脫下來。因為這過程存逡逑在使蛋白質(zhì)活性受損的可能，只用在其他層析方法不能純化到目的蛋白的情況，才使逡逑用疏水層析。逡逑９逡逑

親和層析具有很強的專一性，純化程度高等特點。親和層析是根據(jù)層析介質(zhì)與蛋逡逑白質(zhì)之間的生物學(xué)活性，不是依據(jù)兩者之間的物化特性進行分離。親和層析的配基與逡逑混合物中某一蛋白質(zhì)能夠特異性結(jié)合，而且可以可逆反應(yīng)，見圖１－４。一般使用于帶逡逑有標簽的重組蛋白的純化或者抗原與抗體之間的分離純化。因為該方法具有局限性，逡逑而且成本相對高，較少用于天然蛋白的純化。逡逑（１）邐（２）邐（３）逡逑｜Ａ邋＞Ｘ＾｜ＡＷａＳｈ＾逡逑ＪＣ邋Ｓａｍｐｌｅ邋Ｍ邋｜邋ｗｔ邋＾逡逑ｋｔ邋Ｌ邋＼ｍｂ邋＼：ｋ逡逑親和基團＾邋ｉ邐＾逡逑ｆ配體＊７…ｒ逡逑Ａ■S緬澹ｅ澹ｅ澹ｅ危攏縢？逡逑載體逡逑圖１－４親和層析原理示意圖逡逑Ｆｉｇ．邋１－４邋Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ邋ｏｆ邋ａｆｆｉｎｉｔｙ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ逡逑１０逡逑
【學(xué)位授予單位】：福州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S476

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10 廖富

本文編號：2660005