【摘要】：斜紋夜蛾(tobaccocutworm,Spodopteralitura)屬鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)。斜紋夜蛾是一種世界性的多食性大害蟲,是我國糧、棉、煙草等經(jīng)濟(jì)作物,尤其是蔬菜的重要害蟲。該害蟲可危害109個科共380多種植物,包括蔬菜、果樹、花卉、草坪、棉花、玉米和煙草等。昆蟲生殖行為,是研究性選擇和物種進(jìn)化的基礎(chǔ),對害蟲防治和益蟲利用也有重要意義。神經(jīng)肽是一類特殊的重要信息物質(zhì),主要由腦及其他神經(jīng)分泌細(xì)胞所分泌,具有種類多、含量低、活性高等特點,廣泛調(diào)節(jié)著動物的發(fā)育、生理和行為過程。類速激肽(tachykinins,TKs)是存在于脊椎動物中的一類特殊的神經(jīng)肽。其代表成員有TKs I~IV,DTK1~6和Natalisin(NTL)。NTL存在于果蠅、赤擬谷盜和家蠶等昆蟲中。前人研究發(fā)現(xiàn)NTL在果蠅中可能與交配行為有關(guān),而在赤擬谷盜中則具有調(diào)節(jié)雌蟲產(chǎn)卵的功能,然而NTL在家蠶或其他蛾類昆蟲中是否也具有類似功能有待明確�；谏鲜�,本研究在前期轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步通過RACE技術(shù)克隆了斜紋夜蛾ⅣTL及其受體NTLR(SLA32)基因的全長mRNA序列;再通過實時熒光定量技術(shù)檢測了整個斜紋夜蛾生活史和成蟲不同組織中NTL及SLA32的相對表達(dá)水平;最后采用細(xì)菌介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)對ATL和SLA32進(jìn)行了功能分析,具體結(jié)果如下:(1)NTL mRNA序列全長1593 bp,其5'端和3'非編碼區(qū)(UTR)分別為95 bp和181 bp,其開放閱讀框(ORF)為1317bp,編碼一個438個氨基酸殘基組成的蛋白。SLA32 mRNA全長1618 bp,其5'和3'UTR分別為62 bp和233 bp,其ORF為1323 bp,編碼一個含440個氨基酸的蛋白。同源性分析表明,斜紋夜蛾的NTL和SLA32基因所編碼的蛋白與鱗翅目昆蟲表現(xiàn)出很高的同源性,與其他目的昆蟲則同源性較低。通過跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析表明S1A32是一種典型的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。(2)實時熒光定量分析表明NTL和和SLA32在不同發(fā)育時期的表達(dá)模式相似,即在卵和幼蟲階段較低、在蛹期有所升高而在成蟲期達(dá)到最大,這與該蛾的性成熟和生殖行為發(fā)生呈正相關(guān)。然而在成蟲期間,SLA32的相對表達(dá)量都較NTL有延后現(xiàn)象,即NTL分別在0日齡雄蟲和1日齡雌蟲中出現(xiàn)最高表達(dá),而SLA32則在1日齡雄蟲和2日齡雌蟲中出現(xiàn)最高表達(dá)。這一結(jié)果表NTL和SLA32關(guān)系密切,NTL表達(dá)可能有助于促進(jìn)SLA32的表達(dá)。NTL和SLA32在斜紋夜蛾不同組織中的表達(dá)也表現(xiàn)出一定的規(guī)律性,即頭部的表達(dá)量都高于胸部和生殖系統(tǒng),并且從頭部往下呈現(xiàn)明顯的遞減趨勢,雄蟲頭部的表達(dá)量高于雌蟲頭部的表達(dá)量。這種性間和組織間差異性表達(dá)暗示NTL和SLA32在雌雄間和不同組織間可能產(chǎn)生不同的功能。(3)成功構(gòu)建了NTL和SLA32的細(xì)菌介導(dǎo)的RNA干擾體系,并達(dá)到了較高的干擾效率(60%以上)。干擾NTL和SLA32的表達(dá)顯著降低了斜紋夜蛾雄蟲的求偶和雌蟲的召喚行為,最終導(dǎo)致較低的交配成功率。對照組(喂食無菌水和喂食表達(dá)EGFPdsRNA的大腸桿菌)雌性成蟲的交配百分率分別為l100%和92%,對照組雄蟲交配百分率分別為85%和77%,都有較高的交配率。但實驗組(喂食表達(dá)NTLdsRNA和SLA32 dsRNA的大腸桿菌)雌雄蟲交配百分率都比較低(23-46%)。干擾雌蟲NTL和SLA32的表達(dá)顯著降低了雌蟲的產(chǎn)卵量。干擾雄蟲NTL及SLA32的表達(dá)后,與NTL及SLA32 RNAi雄蟲交配的正常斜紋夜蛾雌蟲其交配后產(chǎn)卵量有所下降。這些結(jié)果表明NTL及其受體SLA32在斜紋夜蛾雌性和雄性生殖行為過程均具有重要作用,并表現(xiàn)出明顯的性間功能差異性和不同的分子機(jī)制。本研究首次克隆了斜紋夜蛾NTL及其受體SLA32基因的全長mRNA序列,并通過RNAi證實了 NTL和SLA32在斜紋夜蛾生殖調(diào)節(jié)過程中的重要作用。本研究也屬首次在鱗翅目昆蟲中證實了NTL和SIA32的功能,為該類昆蟲繁殖機(jī)制的深入探索提供了思路。本研究還首次在斜紋夜蛾中構(gòu)建了細(xì)菌介導(dǎo)的RNA干擾體系,細(xì)菌介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)是一種成本低、高效和一次制備可多次培養(yǎng)使用的基因沉默方法,可在功能研究中廣泛應(yīng)用,并在害蟲防治方面也有較好應(yīng)用前景。
【圖文】：

６、假死性：斜紋夜蛾幼蟲具有假死性，當(dāng)受到驚動時，身體蜷縮成一團(tuán)假死狀。逡逑７、趨光性：成蟲大多在夜晚進(jìn)行取食、交配和產(chǎn)卵，飛行能力較強(qiáng)，對具有強(qiáng)烈的趨性。逡逑８、遷飛性：當(dāng)環(huán)境惡劣，食物不足時，斜紋夜蛾常常成群徖徙。逡逑．２．３斜紋夜蛾各個時期形態(tài)特征逡逑斜紋夜蛾生活史同其他完全變態(tài)類昆蟲一樣具有四個不同的時期：卵、幼、成蟲，其中幼蟲又可分為六個齡期。逡逑卵：斜紋夜蛾的卵集中產(chǎn)成塊狀，一般為２、３層不等的無規(guī)則塊狀，初黃白色，上面覆有黃色的體絨毛（圖１－１：邋Ａ）。每粒卵為直徑０．４？０．５ｍｍ球形，表面網(wǎng)紋狀，有橫脊和縱棱［１６］，孵化前卵呈紫黑色（圖Ｍ：邋Ｂ）。逡逑

Ａ：初孵幼蟲；Ｂ：在人工飼料上取食的－一齡幼蟲；Ｃ：邋１－６齡幼蟲：１為一齡幼蟲，２為二齡逡逑幼蟲，３－４為三齡幼蟲，５－７為四齡幼蟲，８－９為五六齡幼蟲，９為蜷縮狀（即將化蛹）逡逑二齡幼蟲（圖１－２：邋Ｃ－２）：孵化后５？７天，此時幼蟲體長達(dá)４？５邋ｍｍ，體表具逡逑有排列不整齊的不規(guī)則黑點，二齡幼蟲可見背線、亞背線和氣門。以肉眼可見幼蟲逡逑具有三對胸足、四對腹足和一對臀足。二齡幼蟲的假死性和隱蔽性X椙浚艿驕佩義鮮幣不嵬濾肯麓梗佬惺背使靶危鸞シ摯∈騁鍍�，，食翍┎灭嬙札e�，汉V諭Ｖ瑰義轄�，开始o(jì)善�，粪睉C事躺帕Ｗ礎(chǔ)Ｓ捎謔沉康腦齟螅擅饗怨鄄斕接壯嬋惺騁跺義掀蠼鍪Ｒ渡媳砥ず鴕堵觶溆壯媸逼諞彩欽壯嫻淖羆咽逼凇ｅ義先溆壯媯ㄍ跡保玻哄澹茫常矗涸詵躉螅�？９虤e蔽埔茍曖壯娼肴浣錐�，辶x洗聳�，虫体长村P保擔(dān)浚保叮擼逕扇榘妝湮粕猩偈諫蜃蠟疑

本文編號：2660254