【摘要】：雙生病毒是一大類(lèi)在世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害植物及動(dòng)物的單鏈環(huán)狀DNA病毒。煙粉虱Bemisia tabaci屬半翅目粉虱科,是一個(gè)包含至少36個(gè)隱存種的物種復(fù)合群。菜豆金黃花葉病毒屬是雙生病毒科中最大的一個(gè)屬,已記錄400余種,全部是由煙粉虱特異性傳播的植物病毒。煙粉虱以持久循環(huán)型方式傳播雙生病毒。病毒需要克服煙粉虱體內(nèi)的中腸侵染和擴(kuò)散屏障、以及唾液腺侵染和逃逸屏障進(jìn)行植物之間的傳播,需要克服卵巢及卵的侵染屏障進(jìn)行煙粉虱上下代之間的傳播。病毒需要借助于自身結(jié)構(gòu)蛋白與介體昆蟲(chóng)蛋白之間的互作來(lái)幫助自身高效地穿過(guò)這些屏障。然而,雙生病毒穿過(guò)介體煙粉虱體內(nèi)屏障的關(guān)鍵受體蛋白尚未明確。此外,雙生病毒能否在介體煙粉虱體內(nèi)復(fù)制也一直存在爭(zhēng)議。本文針對(duì)這些重要問(wèn)題開(kāi)展研究,結(jié)果如下:1)雙生病毒經(jīng)卵傳播的機(jī)制本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),MEAM 1煙粉虱可以經(jīng)卵傳播番茄黃曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYLCV),而且傳播效率隨著煙粉虱雌成蟲(chóng)日齡的增加而升高,原因是TYLCV進(jìn)入煙粉虱卵巢的效率與卵巢的發(fā)育程度正相關(guān)。然而,中國(guó)番木瓜曲葉病毒(papaya leaf curl China virus,PaLCuCNV)則不能進(jìn)入卵巢,因此也就不能由煙粉虱經(jīng)卵傳播。鑒于卵黃原蛋白(vitellogenin,Vg)在昆蟲(chóng)卵巢發(fā)育中的重要作用,我們推測(cè)Vg可能參與了 TYLCV進(jìn)入卵巢的過(guò)程。這里,我們發(fā)現(xiàn)TYLCV的外殼蛋白(CP)可以與Vg互作,而PaLCuCNV的CP則不能。免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TYLCV通過(guò)與Vg相同的路徑進(jìn)入卵子中。當(dāng)干擾Vg的表達(dá)時(shí),TYLCV進(jìn)入卵巢的量減少,經(jīng)卵傳播的效率也相應(yīng)降低,說(shuō)明TYLCV CP與Vg的結(jié)合可以幫助TYLCV進(jìn)入煙粉虱卵巢。我們還發(fā)現(xiàn),在沒(méi)有病毒寄主植物存在的情況下,TYLCV能以經(jīng)卵傳播的方式在煙粉虱種群中至少存留兩代,且后代成蟲(chóng)依然保持傳播TYLCV的能力。2)TYLCV在煙粉虱體內(nèi)復(fù)制的部位上面的結(jié)果表明,TYLCV可以由煙粉虱經(jīng)卵傳播至少兩代,且后代成蟲(chóng)依然保持傳播TYLCV的能力。這一現(xiàn)象暗示TYLCV可能在煙粉虱體內(nèi)復(fù)制。定量檢測(cè)帶毒煙粉虱所產(chǎn)生的子一代(F1)成蟲(chóng)體內(nèi)的病毒量發(fā)現(xiàn),在Fl成蟲(chóng)羽化后的前11天內(nèi)TYLCV的量逐漸增加,說(shuō)明TYLCV在F1成蟲(chóng)體內(nèi)確實(shí)發(fā)生了復(fù)制。熒光原位雜交和免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),只能在F1成蟲(chóng)的唾液腺中檢測(cè)到TYLCV,中腸中則不能。檢測(cè)長(zhǎng)期持毒過(guò)程中煙粉虱不同組織內(nèi)病毒量的變化情況發(fā)現(xiàn),TYLCV只在唾液腺中積累,而PaLCuCNV則不會(huì)積累。進(jìn)一步檢測(cè)病毒互補(bǔ)鏈DNA的變化以及病毒基因的轉(zhuǎn)錄,結(jié)果同樣表明TYLCV主要在唾液腺的中間區(qū)域復(fù)制,而PaLCuCNV則不能復(fù)制。這些結(jié)果表明,TYLCV可以在煙粉虱體內(nèi)復(fù)制,而復(fù)制主要發(fā)生在唾液腺中部連接唾管的區(qū)域。3)TYLCV在煙粉虱體內(nèi)復(fù)制的機(jī)制為了探究TYLCV在煙粉虱體內(nèi)復(fù)制的機(jī)制,我們測(cè)定了 TYLCV侵染對(duì)MEAM 1煙粉虱唾液腺基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。發(fā)現(xiàn)TYLCV侵染后,唾液腺中許多DNA合成相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生上調(diào),例如增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和DNA聚合酶Δ。也觀察到TYLCV的復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep)可以與煙粉虱PCNA發(fā)生互作,進(jìn)而促進(jìn)病毒復(fù)制。而且,TYLCV的復(fù)制依賴(lài)于煙粉虱的DNA聚合酶δ。相反,PaLCuCNV則不會(huì)誘導(dǎo)煙粉虱的PCNA和DNA聚合酶δ的表達(dá),PaLCuCNV的Rep也不能與PCNA互作。4)TYLCV穿過(guò)中腸腸壁的機(jī)制我們采用中腸特異性免疫共沉淀結(jié)合高效液相質(zhì)譜分析的方法,鑒定到76個(gè)(包括Vg)特異性與TYLCV CP共沉淀的煙粉虱中腸蛋白。因?yàn)榍懊嬉寻l(fā)現(xiàn),TYLCV CP可以與煙粉虱Vg發(fā)生互作,且該互作可以幫助TYLCV克服經(jīng)卵傳播的屏障,所以我們選取Vg進(jìn)行后續(xù)的研究。首先通過(guò)多種手段驗(yàn)證了 Vg確實(shí)在煙粉虱中腸中有表達(dá)。之后通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),TYLCV與Vg在煙粉虱中腸細(xì)胞中存在共定位,而且TYLCV和Vg—起穿過(guò)煙粉虱中腸上皮細(xì)胞,說(shuō)明TYLCV與Vg的互作可能在TYLCV穿過(guò)煙粉虱中腸屏障的過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。當(dāng)使用RNAi干擾Vg的表達(dá)或使用Vg抗體阻斷TYLCV與Vg的互作時(shí),TYLCV穿過(guò)煙粉虱中腸細(xì)胞的效率均顯著降低,說(shuō)明TYLCV與Vg的互作能使TYLCV穿過(guò)煙粉虱中腸這一屏障。這些結(jié)果表明,Vg是TYLCV穿過(guò)煙粉虱中腸腸壁的介體蛋白,同時(shí)也表明中腸是昆蟲(chóng)體內(nèi)除脂肪體以外另一個(gè)合成Vg蛋白的器官。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)了煙粉虱Vg在TYLCV穿過(guò)中腸腸壁和經(jīng)卵傳播的過(guò)程中發(fā)揮重要作用,并初步解析了其作用機(jī)制。同時(shí),證明了TYLCV是可以在煙粉虱體內(nèi)復(fù)制的,并找到了其復(fù)制的主要部位,闡明了復(fù)制的機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)不僅可以幫助我們理解TYLCV近年在全球迅速擴(kuò)散危害的主要內(nèi)在因子,對(duì)改進(jìn)目前防控番茄曲葉病的技術(shù)體系、以及研發(fā)防控該病毒病的新方法提供了新的科學(xué)基礎(chǔ),而且對(duì)理解和探索病毒與媒介昆蟲(chóng)之間互作的復(fù)雜關(guān)系有重要參考價(jià)值。此外,本研究發(fā)現(xiàn)了昆蟲(chóng)體內(nèi)除脂肪體以外另一個(gè)合成Vg蛋白的器官——中腸。
【圖文】：

蛋白邋ＢＶ１邋（ｎｕｃｌｅａｒ邋ｓｈｕｔｔｌｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＳＰ））和邋ＢＣ１邋（ｍｏｖｅｍｅｎｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＰ））（Ｆｏｎｄｏｎｇ，逡逑２０１３）。另外，，在某些單組份和雙姐份病毒ＡＣ３基因的下游還含有一個(gè)保守的ＡＣ５逡逑閱讀框（Ｌｉｅｔａｌ．，２０１５）。不同病毒屬基因姐結(jié)構(gòu)及編碼的蛋白詳見(jiàn)圖１．２（Ｚｅｒｂｉｎｉｅｔ逡逑ａｌ．，２０１７）。逡逑４逡逑

過(guò)ＧＳＴＰｕｌｌ－ｄｏｗｎ的方法來(lái)檢驗(yàn)這兩個(gè)病毒的ＣＰ與煙粉虱Ｖｇ的互作情況。結(jié)果逡逑表明只有ＴＹＬＣＶ邋ＣＰ可以從煙粉虱的總蛋白中拉下Ｖｇ，而ＰａＬＣｕＣＮＶ邋ＣＰ則不能逡逑（圖３．１），說(shuō)明ＴＹＬＣＶ邋ＣＰ可以特異性的和煙粉虱Ｖｇ發(fā)生互作。根據(jù)之前ＴＹＬＣＶ逡逑可以進(jìn)入較成熟的卵巢、而ＰａＬＣｕＣＮＶ不能的結(jié)果，我們推測(cè)病毒ＣＰ與煙粉虱逡逑Ｖｇ之間的互作是決定病毒能否進(jìn)入煙粉虱卵巢的關(guān)鍵因素。逡逑Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ逡逑ＣＰ邋ＧＳＴ邋ＧＳＴ邋？邋．ｒ逡逑邐邐Ｐｕｒｉｆｉｅｄ逡逑Ｃｒｕｄｅ邋ＴＹＬＣＶ邋ＰａＬ邐ＧＳＴ逡逑Ｖｇ邋ｍｍｍ逡逑ＣＰ邋ＧＳＴ邋ｖ：逡逑ＧＳＴ＿：逡逑圖３．１煙粉虱Ｖｇ與ＴＹＬＣＶ邋ＣＰ互作而不與ＰａＬＣｕＣＮＶ邋ＣＰ互作。逡逑Ｆｉｇ邋３．１邋Ｂ．邋ｔａｂａｃｉ邋ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ邋Ｖｇ邋ｃｏｅｌｕｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＧＳＴ－ｆｕｓｅｄ邋ＴＹＬＣＶ邋ＣＰ邋ｂｕｔ邋ｎｏｔ邋ｗｉｔｈ逡逑ＧＳＴ－ｆｌｉｓｅｄ邋ＰａＬＣｕＣＮＶ邋（ＰａＬ）邋ＣＰ．逡逑３．２＿２邋ＴＹＬＣＶ通過(guò)與Ｖｇ相同的路徑進(jìn)入煙粉虱卵母細(xì)胞逡逑昆蟲(chóng)Ｖｇ主要在脂肪體中表達(dá)，然后分泌到血淋巴中，最后被發(fā)育中的卵母細(xì)逡逑胞通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞作用吸收進(jìn)入卵母細(xì)胞（Ｒａｉｋｈｅｌ＆Ｄｈａｄｉａｌｌａ，１９９２）。我們逡逑推測(cè)ＴＹＬＣＶ可能與Ｖｇ結(jié)合在一起，然后通過(guò)Ｖｇ的運(yùn)輸通路進(jìn)入到卵母細(xì)胞中。為逡逑了驗(yàn)證這個(gè)猜測(cè)，我們首先對(duì)煙粉虱卵巢管的形態(tài)和發(fā)育進(jìn)行了觀察。煙粉虱的逡逑卵巢管主要由三部分組成：頂端的滋養(yǎng)區(qū)，中間的隔離卵母細(xì)胞區(qū)和底部的生長(zhǎng)逡逑區(qū)。卵母細(xì)胞處于生長(zhǎng)區(qū)的中間
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S433;S432.41

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2634797