【摘要】：人參(Panax ginseng C.A.Meyer)屬珍貴的多年生草本藥用植物,在中國東北栽培歷史悠久,具有重要的經(jīng)濟和藥用價值。人參菌核病是由人參核盤菌(Sclerotinia ginseng Wang et Chen)引起的一種主要的根部病害,嚴重影響人參的產(chǎn)量和質(zhì)量,導(dǎo)致重大經(jīng)濟損失。分泌液(exudate)是產(chǎn)核真菌在菌核發(fā)育過程中產(chǎn)生的一種重要代謝產(chǎn)物,與菌核的發(fā)育和致病密切相關(guān)。本文采用植物病理學(xué)和分子生物學(xué)研究方法對人參核盤菌分泌液的生物學(xué)特性、代謝成分、蛋白組分、致病作用及影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)作用進行了系統(tǒng)的研究,旨在揭示人參菌核分泌液在菌核生長發(fā)育和致病過程中的作用,研究結(jié)果如下。1.系統(tǒng)研究了人參核盤菌分泌液的致病機制。人參核盤菌分泌液中含有多聚半乳糖醛酸酶(PG)和羧甲基纖維素酶(Cx)。與菌絲中鑒定出的細胞壁降解酶比較,分泌液中的PG酶活性顯著高于菌絲中的PG酶活性,Cx酶活性較菌絲中低。分泌液接種人參根部可以形成侵染病斑,對參根組織產(chǎn)生分解作用,同時可誘導(dǎo)人參根部多種防御酶系(PAL,POD,CAT,SOD,PPO)的上升。研究觀察發(fā)現(xiàn),相較菌絲侵染參根,分泌液具有侵染快速,致病力強,病程持續(xù)時間短,病斑擴散速度慢等特點。2.對人參核盤菌分泌液的生物學(xué)特性進行了系統(tǒng)研究。通過生物學(xué)特性研究表明,PDA為供試菌株產(chǎn)生分泌液的最適培養(yǎng)基,適宜菌絲生長的碳源為蔗糖,最適宜分泌液產(chǎn)生的碳源是葡萄糖。蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉這三種有機氮能顯著的促進菌絲的生長。當(dāng)以酵母浸粉為氮源時,人參核盤菌產(chǎn)核數(shù)量最多,顯著高于其他氮源。并且在酵母培養(yǎng)基中菌核的鮮重、干重和產(chǎn)分泌液總量均顯著高于其他氮源。當(dāng)葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉濃度在60 g/L時出現(xiàn)最快生長速率,但相同濃度下,葡萄糖更有利于菌絲的生長。當(dāng)碳源為葡萄糖且濃度為30 g/L時,分泌液形成量最多。1.5 g/L酵母浸粉濃度下菌絲生長速率顯著高于其他條件。酵母浸粉在濃度范圍為2.0~3.0 g/L時,分泌液生成量顯著高于其他濃度。高濃度的酵母浸粉有助于菌核的形成,但卻會抑制分泌液的產(chǎn)生。供試菌株在酵母浸粉濃度為3 g/L,蔗糖濃度為30 g/L時的菌絲生長速率最快,并且分泌液產(chǎn)量顯著高于其他處理組。供試菌株的菌絲生長、菌核及分泌液的生成的最適pH為5。3.首次證明人參核盤菌分泌液具有影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的作用。與空白對照相比,不同濃度的分泌液對人參核盤菌的生長均起到促進作用,濃度為4%時菌絲生長速率明顯加快。通過比較不同處理條件下對人參根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響,在對細菌的UPGMA分類樹分析發(fā)現(xiàn)分泌液處理組與菌懸液處理組可使土壤中的細菌群落結(jié)構(gòu)向更為相似的組成發(fā)展,而通過對真菌的UPGMA分類樹分析發(fā)現(xiàn)分泌液處理組與分泌液+菌懸液處理組可產(chǎn)生較為相似的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。并且從真菌UPGMA分類樹還可以觀察到分泌液處理組,菌懸液處理組和分泌液+菌懸液處理組的真菌群落中子囊菌門真菌豐度較高,說明分泌液和菌懸液在影響土壤真菌群落組成及豐富度上有一定程度的相似作用。4.首次對人參核盤菌分泌液的成分進行鑒定。利用火焰原子吸收光譜法(FAAS),納氏試劑分光光度法,高效液相色譜法(HPLC)以及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS),明確人參核盤菌分泌液中含有K,Na和Mg離子、游離氨、草酸、咖啡酸、阿魏酸、沒食子酸、單寧酸、香草酸、肌醇、葡萄糖和海藻糖。通過鑒定出的分泌液成分可以進一步推測分泌液在致病和影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)上起到一定程度的作用。5.利用轉(zhuǎn)錄組學(xué),首次提供高質(zhì)量的人參核盤菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),并對人參核盤菌和核盤菌進行了比較分析。從樣品中組裝出14,904個獨立基因(unigenes),有12,424個獨立基因被注釋。通過GO功能分析,發(fā)現(xiàn)在3個組別中富集最多的亞組有細胞進程,代謝進程,細胞,細胞部分,催化活性和轉(zhuǎn)運活性。將核盤菌與人參核盤菌進行比較,發(fā)現(xiàn)有17,638個同源基因,證明兩種病原菌具有較高的親緣性。對組裝的pg1,pg3,pg5和pg6基因進行進化分析,發(fā)現(xiàn)pg1,pg3和pg6均與核盤菌屬真菌分到一起,pg5與小核菌屬中的Sclerotium cepivorum分到了一起。4個pg基因明顯的分到不同的4個類群中,可以證明每個基因在進化方面都是相對獨立的。對鑒定出了兩個pac1同源基因進行遺傳進化分析,發(fā)現(xiàn)人參核盤菌的pac1同源基因與Sclerotinia sclerotiorum,S.cepivorum和Dumontinia tuberosa分到一起。這可以說明pac1基因在所選取的分類樣本中具有高度的保守性。6.首次利用蛋白組學(xué)技術(shù)對人參核盤菌分泌液的蛋白組分進行分析。通過蛋白組學(xué)技術(shù)鑒定出人參核盤菌分泌液中的59個非冗余蛋白質(zhì)。通過生物信息學(xué)分析將鑒定出的蛋白歸為6類,分別是碳水化合物代謝組(39%),氧化還原進程組(12%),轉(zhuǎn)運和分解代謝組(5%),氨基酸代謝組(3%),其他功能組(18%)和未知功能蛋白組(23%)。在碳水化合物代謝組中,有許多蛋白參與到真菌細胞壁的重塑和修飾,部分蛋白與病原菌的致病性相關(guān)。未知功能功能蛋白組中有一類蛋白是在菌核發(fā)育過程中特異性表達的蛋白(Ssp1)。氧化還原進程組中的許多蛋白與真菌黑色素形成有關(guān)。
【圖文】：

540吸光度值（y）對應(yīng)響應(yīng)的半乳糖醛酸標準液中半乳糖醛酸的含量（x），，用Microsoft Excel 2010進行標準曲線的繪制（圖2-1）。圖 2-1 半乳糖醛酸含量標準曲線Fig. 2-1 The standard curve of galacturonic acid content根據(jù)測得的不同OD540吸光度值（y）對應(yīng)響應(yīng)的葡萄糖標準液中葡萄糖的含量（x），用Microsoft Excel 2010進行標準曲線的繪制（圖2-2）。

葡萄糖含量標準曲線
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S435.675

【參考文獻】

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本文編號：2634680