【摘要】：蠟蚧菌(Lecanicillium lecanii)是一種優(yōu)良的蟲生真菌,對農(nóng)業(yè)病蟲害具有很好的防治效果。然而,蠟蚧菌在應(yīng)用時(shí)為活菌制劑,殺真菌劑對其有致命的影響,在田間不能與殺菌劑等化學(xué)藥劑同時(shí)施用。針對蠟蚧菌對殺菌劑敏感的問題,有必要對蠟蚧菌進(jìn)行菌株改良而用于生物防治。本研究篩選對甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑具有高抗性的真菌菌株,克隆其抗性基因,利用其抗藥性基因轉(zhuǎn)化蠟蚧菌的敏感菌株,篩選獲得抗性較強(qiáng)的轉(zhuǎn)化子,為蠟蚧菌的田間應(yīng)用提供基礎(chǔ)。研究已取得了如下結(jié)果。1.篩選對甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑具高抗性的真菌菌株。從分離純化的多類植物病原菌中,應(yīng)用孢子萌發(fā)法,篩選對醚菌酯藥劑表現(xiàn)出高抗藥性水平的菌株F-2。F-2菌株對醚菌酯的EC_(50)值大于2500μg/ml(田間常用濃度為250μg/ml)。菌株經(jīng)ITS序列測序鑒定為極細(xì)枝孢菌(Cladosporium tenuissimum)。2.克隆抗性基因。從篩選得到的高水平抗藥性突變菌株F-2菌株中,克隆抗藥性高抗性基因Cytb,同時(shí)從野生型敏感性枝孢菌菌株B-3中也克隆出Cytb抗性基因,二者Cytb基因編碼區(qū)序列進(jìn)行比較分析。通過普通PCR和3'RACE實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增出Cytb基因編碼區(qū)序列全長,二者序列比對后,結(jié)果為F-2菌株在核酸編碼區(qū)序列429位點(diǎn)處發(fā)生堿基突變,氨基酸序列中143位點(diǎn)的氨基酸由甘氨酸突變?yōu)楸彼?G143A)。因此,F-2菌株對醚菌酯藥劑表現(xiàn)出高抗藥性水平,與甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的已知抗性機(jī)制相符合。3.構(gòu)建表達(dá)載體。構(gòu)建Cytb抗藥性突變基因的真菌ATMT表達(dá)載體,以pBHt2載體為基礎(chǔ),應(yīng)用重疊PCR方法連接真菌表達(dá)強(qiáng)啟動子PtrpC基因和Cytb抗性基因兩個(gè)片段。然后,利用T4DNA連接酶將KpnI和HindIII雙酶切后的pBHt2載體和連接目的片段連接起來,構(gòu)建含Cytb抗藥性基因的pBHt2重組質(zhì)粒。4.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化蠟蚧菌。將構(gòu)建成功的含Cytb抗藥性突變基因的pBHt2重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌AGL-1中;然后,通過農(nóng)桿菌和蠟蚧菌分生孢子共培養(yǎng)的方法,實(shí)現(xiàn)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蠟蚧菌的轉(zhuǎn)化,將外源Cytb抗藥性基因?qū)胂烌痪?獲得含Cytb抗藥性基因的轉(zhuǎn)化子菌株,并對轉(zhuǎn)化子菌株進(jìn)行一系列驗(yàn)證。5.轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證。以轉(zhuǎn)化子菌株基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增出目的片段,證明外源Cytb抗藥性基因已成功導(dǎo)入蠟蚧菌;以轉(zhuǎn)化子菌株cDNA為模板,RT-PCR擴(kuò)增出目的片段,證明外源Cytb抗藥性基因已成功在蠟蚧菌中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng);測定轉(zhuǎn)化子菌株對醚菌酯藥劑的抗藥性,結(jié)果得轉(zhuǎn)化子菌株對醚菌酯抗藥性最高提高了7.7倍,證明外源Cytb突變基因已成功在蠟蚧菌中翻譯并表達(dá)。由此獲知,對醚菌酯具有抗藥性的蠟蚧菌工程菌株構(gòu)建取得成功,菌株抗藥性顯著提高,具有很好的應(yīng)用前景。
【圖文】：

圖 2.1：ITS 序列電泳圖Fig 2.1: ITS Sequence 1 為 F-1 菌株，泳道 2 為 F-2 菌株道 5 為 Y-5 菌株，泳道 6 為 CZQ-2: F-1 strain, Lane 2: F-2 strain, Lane Y-5strain, Lane 6: CZQ-2 strainCBI 網(wǎng)站中的 Blast 比對分析Cladosporium tenuissimum）；sporium westerdijkieae；CZQ-2 以 Talaromyces 屬（曲霉屬）為）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖可知F-2、B-3、C-4、Y-5 菌株與 CY-5 菌株均屬于 Cladosporium Q-2 菌株屬于 Penicillium 屬。

rimer rimer Mix (Colony) 98°C 10 s，55°C 10 s，72°C 20 樣，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測有無條+或 LB/Kan+的液體培養(yǎng)基中，2的限制性內(nèi)切酶，酶切鑒定陽性13R 測序，，分析序列。取下圖所示，從圖 3.1 中可以明顯看1 2 3 4 M
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TQ455

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2634871