【摘要】：小豆(Vigna angularis)是我國傳統(tǒng)的雜糧作物,因其生育期短、耐瘠薄等特點,在當(dāng)前農(nóng)業(yè)種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中占據(jù)重要地位。然而,由豇豆單胞銹菌(Uromyces vignae)引起的小豆銹病,可導(dǎo)致小豆葉片干枯提前落葉,嚴(yán)重影響了小豆的產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究小組前期利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn),抗銹病小豆品種“QH1”中,接種銹菌后24 h多個WRKY轉(zhuǎn)錄因子顯著上調(diào)表達,因而推測小豆WRKY基因在小豆抗銹病中發(fā)揮了重要作用。WRKY轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物的抗病過程,調(diào)控植物抗病反應(yīng)及抗病信號通路,如水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)及乙烯(ET)等。因此,為進一步明確小豆WRKY轉(zhuǎn)錄因子在抗銹病中的功能,本研究利用小豆全基因組數(shù)據(jù),采用生物信息方法,鑒定了小豆基因組中全部WRKY轉(zhuǎn)錄因子,并對WRKY家族成員的染色體定位、進化及序列特征等進行了系統(tǒng)分析,同時,采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)分析了銹菌侵染不同時期,小豆WRKY轉(zhuǎn)錄因子在抗、感不同品種中的表達情況,并以小豆基因組DNA為模板,克隆了VaWRKY33基因全長,初步明確了VaWRKY33在抗銹病中的作用及其與乙烯抗病信號通路的關(guān)系。取得的主要研究結(jié)果如下:1.采用生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn),小豆基因組中共有90個WRKY轉(zhuǎn)錄因子,不均勻分布于小豆11條染色體上,最多的為3號染色體有12個,最少的為8號染色體僅有1個,另有18個沒有定位到染色體上。對小豆WRKY蛋白序列的分析表明,WRKY結(jié)構(gòu)域高度保守,由WRKYGQK七肽域和鋅指結(jié)構(gòu)組成,依據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)類型,可將小豆WRKY基因家族分為GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ等3個亞家族,分別包含17、61和12個成員。此外,依據(jù)進化關(guān)系,GroupⅡ亞家族可分為Ⅱ-a(6個)、Ⅱ-b(16個)、Ⅱ-c(21個)、Ⅱ-d(7個)和Ⅱ-e(11個)5個亞組。2.基于課題組前期抗病品種接種銹病病菌后24和48 h的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),分析了小豆全部WRKY基因的表達情況,檢測發(fā)現(xiàn)有82個成員不同程度表達,其中16個成員于接種后24 h被顯著誘導(dǎo)表達,18個成員于接種后48 h顯著上調(diào),另有24個成員在接種后24和48 h均顯著上調(diào)表達,其余成員則不受銹菌侵染誘導(dǎo),可能在生長發(fā)育中發(fā)揮調(diào)控作用。為深入了解WRKY基因在小豆抗銹病中的作用,選取其中19個成員,采用qRT-PCR技術(shù)分析了候選基因在“QH1”(抗病)和“寶清紅”(BQH,感病)中應(yīng)答銹菌侵染的表達模式,結(jié)果表明,在“QH1”中,候選19個成員有5個在侵染前期(接種后12和24 h)顯著上調(diào),有6個成員在接菌后48和120 h被顯著誘導(dǎo),另外8個成員則在侵染后期(接種后192 h)顯著上調(diào)表達;在感病品種“寶清紅”中,候選19個成員中有8個在侵染前期(接種后12和24 h)顯著上調(diào)表達,有3個成員在接菌后48和120 h被顯著誘導(dǎo),另外8個成員則在侵染后期(接種后192 h)顯著上調(diào)表達,說明小豆WRKY基因家族的不同成員可能在小豆響應(yīng)銹菌侵染的不同階段發(fā)揮重要的調(diào)控作用。3.研究發(fā)現(xiàn),WRKY33及其同源蛋白可能通過乙烯信號通路參與植物的免疫調(diào)控,課題組前期研究表明乙烯合成前體1-氨基環(huán)丙烷羧酸(ACC)可顯著提高小豆對銹病的抗性,為深入了解VaWRKY33是否通過乙烯通路參與小豆抗銹性,本研究以基因組DNA為模板,克隆了該基因全長,測序結(jié)果表明VaWRKY33全長2442 bp,包含4個內(nèi)含子。進一步采用qRT-PCR技術(shù)分析了ACC處理對VaWRKY33表達的影響,結(jié)果表明,與水處理相比,ACC處理后48-240 h,VaWRKY33表達量均顯著高于對照,且處理后60 h表達水平最高,為對照的57.02倍。此外,ACC處理后2 d接種銹菌,接種同時測得VaWRKY33的表達量是對照處理的285.29倍,并呈持續(xù)升高的趨勢,至接菌后24 h表達量達到峰值。上述結(jié)果表明,小豆VaWRKY33基因受ACC誘導(dǎo)顯著上調(diào),且在ACC激發(fā)并挑戰(zhàn)接種后仍持續(xù)上調(diào)表達,暗示VaWRKY33可能通過乙烯信號通路正調(diào)控小豆抗性。
【圖文】：

結(jié)果與分析家族成員 WRKY 保守域和鋅指結(jié)構(gòu)的序列特征及其分布，結(jié)果域數(shù)量及鋅指結(jié)構(gòu)的類型，可將小豆 90 個 WRKY 家族成員分為族。其中 Group Ⅰ包含 17 個成員，在 N 端和 C 端各有一個保守的鋅指結(jié)構(gòu)在序列特征上存在差異，N 端的鋅指結(jié)構(gòu)為 CX4C22HXH構(gòu)為 CX4C23HXH（圖 1-1）。除鋅指結(jié)構(gòu)存在差異外，WRKY 七肽異，如 XP_017441624.1 的 N 端 WRKY 七肽域第六位點由谷氨酰WRKYGEK），，XP_017434665.1 的 C 端 WRKY 七肽域則整體丟失

20圖 1-2 小豆 WRKY 基因 Group Ⅱ成員多序列比對結(jié)果ig.1-2 Results of multiple sequence alignment of adzuki bean Group Ⅱ member of WRKY ge框標(biāo)注為鋅指結(jié)構(gòu)在半胱氨酸（C）和組氨酸（H）中間存在氨基酸缺失突變；箭頭：個組氨酸（H）中間存在 1 個單插入突變。box indicates that zinc finger structure has amino acid deletion mutation between cysteine (H). The arrow is marked as a zinc finger structure with a single insertion mutation in the histidine (H).roup Ⅲ亞家族共有 12 個成員，其結(jié)構(gòu)與 Group Ⅱ亞家族相似，也只含有一個，但其鋅指結(jié)構(gòu)類型不同，為 C2HC 型（CX7C23HXC），該亞族成員的多序明（圖 1-3），其七肽域為典型的 WRKYGQK，沒有出現(xiàn)位點變異。但個別構(gòu)存在突變，如 XP_017485491.1 的鋅指結(jié)構(gòu)在兩個半胱氨酸（C）中間存在缺失突變（圖 1-3，方框）。
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S435.21

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