發(fā)布時(shí)間：2020-04-01 14:56

【摘要】：黃萎病(Verticillium dahliae)是我國(guó)乃至世界棉花生產(chǎn)上的重要病害,寄主的抗病機(jī)制不清是病害有效控制的瓶頸問(wèn)題。本文通過(guò)對(duì)抗病品種和感病品種經(jīng)黃萎病菌誘導(dǎo)前后根部蛋白的磷酸化分析,獲得一個(gè)差異顯著的類(lèi)受體蛋白激酶GhPR5K。利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)技術(shù)驗(yàn)證其在棉花抗黃萎病過(guò)程中的功能,并進(jìn)一步分析其防御反應(yīng)機(jī)制,篩選其互作的蛋白。取得的主要結(jié)果如下:1.利用黃萎病菌Vd080侵染抗病品種中植棉2號(hào)和感病品種冀棉11號(hào),進(jìn)行修飾蛋白質(zhì)組定量分析,共檢測(cè)到1716個(gè)磷酸化蛋白,其中639個(gè)顯著差異的蛋白,主要涉及到植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、MAPK信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、植物病原互作及mTOR信號(hào)通路等。其中,Gh_D04G1868在中植棉2號(hào)處理組與對(duì)照組間的差異倍數(shù)最高,達(dá)到了12.69,而在冀棉11號(hào)處理組與對(duì)照組間的差異不顯著。同源性比較發(fā)現(xiàn)Gh_D04G1868與擬南芥的病程相關(guān)蛋白激酶AtPR5K相似性達(dá)到了84.7%,因此將其命名為GhPR5K。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),接種Vd080后,GhPR5K在中植棉2號(hào)中的表達(dá)量大幅度提高,初步推斷GhPR5K參與了棉花對(duì)黃萎病的防御反應(yīng)。2.基因克隆得到了GhPR5K全長(zhǎng)。其CDS全長(zhǎng)1887bp,編碼628個(gè)氨基酸,位于Dt_chr12染色體上。蛋白序列分析表明,在252-274堿基區(qū)內(nèi)有一個(gè)跨膜區(qū),N端有一個(gè)信號(hào)肽,C端有一段絲氨酸/蘇氨酸富集區(qū)域。3.利用VIGS技術(shù),成功地在棉花中沉默該基因。接種試驗(yàn)表明,沉默植株葉片大量變黃、萎蔫,甚至脫落、枯死;而對(duì)照植株葉片變黃、萎蔫明顯較輕,沒(méi)有嚴(yán)重的脫落和枯死植株。接種后20d和25d,TRV:GhPR5K的病情指數(shù)分別為19.5和54.2,顯著高于對(duì)照植株的10.3和25.2,表明GhPR5K正調(diào)控棉花對(duì)黃萎病的抗性。進(jìn)一步遺傳轉(zhuǎn)化煙草,獲得在選擇性培養(yǎng)基上表現(xiàn)為陽(yáng)性的煙草植株12株。4.將TRV:00和TRV:GhPR5植株接種Vd080,觀察其防御反應(yīng),分析防御相關(guān)基因的表達(dá)量。結(jié)果表明,與TRV:00植株相比,TRV:GhPR5K植株葉片中活性氧爆發(fā)減少、死細(xì)胞數(shù)較多,莖部木質(zhì)化程度減弱,莖部定殖有更多的棉花黃萎病菌,維管束褐變程度顯著加重。qRT-PCR分析表明,與TRV:00相比,PR基因在TRV:GhPR5K植株均顯著下降,4CL、CHI、PAL、POD、CAD、C4H1最高分別下降70.95%、43.57%、55.33%、43.47%、78.09%和71.89%。表明TRV:GhPR5K植株對(duì)黃萎病的防御反應(yīng)明顯減弱。5.通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)篩選出GhPR5K的互作蛋白DNA J,生物信息學(xué)分析表明,該蛋白N段有一個(gè)22個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的信號(hào)肽、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)、C段有一個(gè)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域,預(yù)測(cè)該結(jié)構(gòu)域可能是為GhPR5K蛋白互作的主要結(jié)構(gòu)域。上述研究部分明確了GhPR5K抗黃萎病的分子機(jī)制,獲得的GhPR5K超表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草及互作蛋白仍需要進(jìn)一步的檢測(cè)、驗(yàn)證和分析。
【圖文】：

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引 言2圖1.1 植物類(lèi)受體蛋白激酶模式圖Figure 1.1 Model of plant receptor-like protein kinases1.2 類(lèi)受體蛋白誘導(dǎo)植物抗病的作用機(jī)理1.2.1 類(lèi)受體蛋白激酶的磷酸化反應(yīng)和抗病防御反應(yīng)蛋白質(zhì)的磷酸化是信號(hào)傳遞過(guò)程中的重要化學(xué)反應(yīng)之一，經(jīng)胞內(nèi)激酶域在蛋白質(zhì)的氨基酸羥基側(cè)鏈上轉(zhuǎn)入ATP的λ位磷酸基團(tuán)來(lái)完成的(Smith et al.,1996)。雖然編碼不同抗性的蛋白的RLKs各不相同,但其在抗病過(guò)程中都有以下三個(gè)過(guò)程:①胞外結(jié)構(gòu)域與配體識(shí)別并結(jié)合；②通過(guò)磷酸化等化學(xué)反應(yīng)傳遞信號(hào)；③下游靶蛋白被激活誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗性(Park et al.,2008)。研究發(fā)現(xiàn),只有將RLKs磷酸化后形成復(fù)合體，才能調(diào)控下游的靶標(biāo)(Wang et al.,2006; Jeong et al.,1999)。病原信號(hào)分子經(jīng)植物細(xì)胞外的受體識(shí)別后，植物發(fā)生抗病防御反應(yīng)，誘導(dǎo)植物的系統(tǒng)獲得抗性(systemic acquired resistance,SAR)及過(guò)敏反應(yīng)( hypersensitive response,HR)(Gozzo et al.,2003)。病原信號(hào)分子在與受體識(shí)別后激活了植物的抗病信號(hào)通路，誘發(fā)HR，致使植物發(fā)病部位發(fā)生程序性細(xì)胞死亡( programmed cell death, PCD)(石軍等,2006)。此過(guò)程可迅速阻斷病原菌擴(kuò)散，引起活性氧爆發(fā)( ractive oxygen species,ROS)，從而殺滅侵入的病原菌(張林青等

圖 1.2 RLKs 抗病防御反應(yīng)示意圖Fig 1.2 The schematic representation of RLKs resistance to pathogens and defense responses1.3 植物磷酸化蛋白質(zhì)組研究現(xiàn)狀蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)修飾研究中最深入的領(lǐng)域之一，在調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。磷酸化酶和激酶網(wǎng)絡(luò)的精確調(diào)控可通過(guò)磷酸化修飾來(lái)完成，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)及胞內(nèi)外生物刺激反應(yīng)等(甄艷等,2014)。蛋白質(zhì)磷酸化包括蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化修飾(Peck etal.,2003;Khan et al.,2005;Chou et al.,1999; Chou et al.,2004;Hubbard et al.,1993)。磷酸化是指在蛋白激酶的催化作用下供體磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的過(guò)程。去磷酸化是在磷酸化酶的催化作用下完成的(圖 1.3)。蛋白質(zhì)磷酸化在真核生物中主要發(fā)生在蘇氨酸、絲氨酸和酪氨酸殘基上；天冬氨酸、谷氨酸和組氨酸則更容易在原核生物中發(fā)生磷酸化(姜錚等,2009;張倩等,2006)。蛋白質(zhì)磷酸化不僅參與酶促反應(yīng)，還能介導(dǎo)蛋白活性(梁前進(jìn)等,2012)，，在參與調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞變異與轉(zhuǎn)化、蛋白激酶的激活等過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用(Hunter etal.,2000;Wan et al.,2008)。細(xì)胞中蛋白質(zhì)磷酸化中的細(xì)微差異都可能導(dǎo)致細(xì)胞代謝水平上的變化(張倩等,2006)。因此，蛋白質(zhì)磷酸化對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響是全方位的。目前為止，蛋白質(zhì)的可逆磷酸化是已知生物體內(nèi)最主要的信號(hào)傳遞方式(Yang et al.,1997)。一些研究預(yù)測(cè)真核生物細(xì)胞磷
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S435.62

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2610604