本文關(guān)鍵詞：家蠶蛹表達(dá)人生長激素蛋白及其生物活性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《浙江大學(xué)》 2009年

家蠶蛹表達(dá)人生長激素蛋白及其生物活性的研究

藍(lán)航蓮  

【摘要】：人生長激素(hGH)是由人垂體前葉細(xì)胞分泌的一種多肽類激素,對機(jī)體的組織、器官以及各種代謝活動都起著重要的生理功能。本試驗首先構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a—hGH,經(jīng)終濃度為1 mM IPTG在大腸桿菌中誘導(dǎo)帶rhGH融合蛋白的表達(dá),融合蛋白帶有His_6標(biāo)簽;純化得到無生物活性的融合蛋白作為抗原免疫雄性新西蘭大白兔,收集抗血清后采用硫酸銨沉淀方法純化多克隆抗體;抗血清的效價為1:25600;Western blot結(jié)果顯示多克隆抗體存在較高的特異性,以rhGH為抗原制得的抗體也可以和hGH蛋白發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。高效抗—hGH多克隆抗體的制備為下游的工作奠定了基礎(chǔ)。 昆蟲桿狀病毒是與原核、酵母以及哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)并存的表達(dá)外源蛋白的一類重要表達(dá)系統(tǒng),因其可以高效表達(dá)有活性的外源蛋白而被廣泛應(yīng)用。家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是昆蟲桿狀病毒的重要組成部分,本試驗利用該系統(tǒng)在受體家蠶細(xì)胞和蠶蛹中合成hGH。利用共轉(zhuǎn)染技術(shù)攜帶有hGH基因的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBacPAK—hGH與線性化的BmBacPAK6基因組DNA在家蠶細(xì)胞中發(fā)生同源重組,產(chǎn)生有插入hGH基因的重組家蠶桿狀病毒;利用空斑分析以及l(fā)ac—Z基因的藍(lán)白篩選純化重組病毒vBmhGH,并通過Southern雜交驗證重組病毒基因組中的hGH基因。TCID50檢測重組病毒的滴度為6.0×10~8 PFU/ml;家蠶細(xì)胞感染vBmhGH表達(dá)rhGH,最大表達(dá)量為約52μg/10~6細(xì)胞;家蠶蛹感染vBmhGH,在血淋巴中檢測到rhGH,并且感染病毒120 h后rhGH的合成達(dá)到最大值約300μg/蛹;制取感染vBmhGH的蠶蛹血淋巴,利用凝膠層析、IP以及RPC的方法分離純化rhGH,結(jié)果從1 ml血淋巴中可以分離得到約180μg rhGH;進(jìn)一步的體外細(xì)胞試驗表明,蠶蛹表達(dá)的rhGH可以促進(jìn)K562細(xì)胞的集落形成;對去垂體大鼠進(jìn)行灌喂給藥,結(jié)果rhGH不僅可以促進(jìn)大鼠體重的增加,也可以促進(jìn)肝臟以及脛骨的生長,表明蠶蛹表達(dá)的hGH具有體內(nèi)生物活性。同時研制的hGH口服膠囊經(jīng)動物急性毒性和長期毒性試驗等臨床前研究表明,hGH口服膠囊無明顯的急性毒性,長期服用hGH口服膠囊無明顯的毒副作用。因此家蠶蛹表達(dá)的rhGH有望在將來成為一種潛在的口服給藥治療呆小癥和阿爾茨海默氏病等hGH缺乏相關(guān)疾病的潛在蛋白類藥物。hGH口服膠囊的動物抗氧化試驗和果蠅壽命延長試驗表明,其可以顯著降低心臟脂褐素含量和提高肝臟SOD比活力,延長果蠅平均壽命。因此我們研制的hGH口服膠囊具有延緩衰老的功效,是一種潛在的口服給藥抗衰老蛋白類藥物。利用蠶蛹高效表達(dá)有生物活性的rhGH為拓展hGH的應(yīng)用領(lǐng)域,開發(fā)基于hGH的藥品和保健品打下了良好的基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：Q78
【目錄】：

縮略詞(Abbreviation)8-10

中文摘要10-12

Abstracts12-14

第一章 文獻(xiàn)綜述和試驗設(shè)計14-47

第一節(jié) 人生長激素(hGH)研究進(jìn)展14-28

1.hGH的結(jié)構(gòu)14-16

2.hGH的生理功能16-19

3.hGH的制備、提純19-21

4.hGH的測定方法21-22

5.hGH的臨床應(yīng)用22-28

第二節(jié) 家蠶桿狀病毒(BmNPV)表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展28-36

1.桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的建立及其原理28-29

2.桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)的改進(jìn)29-33

3.桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)的特點33-34

4.家蠶/BmNPV系統(tǒng)相對于Sf細(xì)胞/AcNPV系統(tǒng)的優(yōu)勢34-36

第三節(jié) 試驗設(shè)計方案36-38

1.試驗?zāi)康暮鸵饬x36

2.本研究的主要內(nèi)容36-37

3.試驗流程圖37-38

參考文獻(xiàn)38-47

第二章 hGH融合蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備47-71

1.材料與方法47-62

1.1 材料、試劑及儀器47-53

1.2 實驗方法53-62

2.結(jié)果與討論62-69

2.1 重組質(zhì)粒pET28a—hGH的構(gòu)建62-64

2.2 E.coli療中重組蛋白rhGH的誘導(dǎo)表達(dá)64-66

2.3 rhGH重組蛋白的純化66-67

2.4 兔抗rhGH抗血清的效價測定67-68

2.5 純化多克隆抗體的特異性鑒定68-69

3.結(jié)論69-70

參考文獻(xiàn):70-71

第三章 重組家蠶桿狀病毒vBmhGH的構(gòu)建及純化71-94

1.材料與方法72-84

1.1 材料72-74

1.2 方法74-84

2.結(jié)果與討論84-91

2.1 重組質(zhì)粒pBacPAK—hGH的鑒定84-85

2.2 家蠶桿狀病毒Bm-BacPAK_6基因組DNA的線性化85-86

2.3 共轉(zhuǎn)染及重組病毒的純化86-88

2.4 重組病毒的鑒定88-89

2.5 重組病毒滴度的測定89-91

3.結(jié)論91-92

參考文獻(xiàn)92-94

第四章 rhGH在家蠶細(xì)胞以及蠶蛹中的表達(dá)94-110

1.材料與方法94-100

1.1 材料94-95

1.2 方法95-100

2.結(jié)果與討論100-108

2.1 hGH標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制100

2.2 rhGH在家蠶細(xì)胞中的合成100-102

2.3 rhGH基因在蠶蛹中的表達(dá)102-105

2.4 rhGH的純化105-108

3.結(jié)論108-109

參考文獻(xiàn)109-110

第五章 蠶蛹表達(dá)rhGH的生物活性研究110-127

1.材料與方法110-115

1.1 材料110-111

1.2 方法111-115

2.結(jié)果與討論115-123

2.1 rhGH促人紅白血病細(xì)胞克隆形成115-116

2.2 去垂體大鼠的體重增加試驗116-117

2.3 去垂體大鼠的肝重增加以及脛骨試驗117-118

2.4 hGH口服膠囊小鼠抗氧化實驗結(jié)果118-119

2.5 hGH口服膠囊果蠅生存期實驗結(jié)果119

2.6 hGH口服膠囊NIH小鼠和SD大鼠急性毒性試驗結(jié)果119

2.7 hGH口服膠囊SD大鼠長期毒性試驗結(jié)果119-123

3.結(jié)論123-125

參考文獻(xiàn)125-127

致謝127

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中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 藍(lán)航蓮;家蠶蛹表達(dá)人生長激素蛋白及其生物活性的研究[D];浙江大學(xué);2009年

2 李偉;人生長激素受體拮抗劑對STZ誘發(fā)的大鼠糖尿病腎小球硬化的影響[D];中國科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2003年

3 梁道明;重組人生長激素對人胃癌裸鼠移植瘤及骨髓的影響[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2008年

4 王峻峰;生長激素缺乏癥的病因?qū)W研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1995年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張昕泂;1.家蠶細(xì)胞瞬時表達(dá)人生長激素基因組DNA 2.昆蟲細(xì)胞抗微生物肽啟動子的誘導(dǎo)活性的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2002年

2 張毅;重組人生長激素對腹腔化療大鼠骨髓影響的實驗研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2004年

3 梁道明;重組人生長激素在體內(nèi)外對人胃癌細(xì)胞生長的影響[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2003年

4 宋曉妍;人生長激素真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其瞬時表達(dá)[D];鄭州大學(xué);2006年

5 扶新芝;重組人生長激素直腸栓劑的制備及其穩(wěn)定性的研究[D];吉林大學(xué);2007年

6 劉紅軍;人胎盤組織cDNA文庫的構(gòu)建及人生長激素cDNA的克隆[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2007年

7 宋向鳳;人生長激素基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)及對免疫功能的影響[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2003年

8 張運歆;重組人生長激素對荷瘤裸鼠血清中GH、IGF-Ⅰ、IGFBP和VEGF的影響[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2008年

9 邵波;新型促血小板生成融合蛋白體內(nèi)分布與免疫原性實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2006年

10 石文;燒傷大鼠腸粘膜細(xì)胞凋亡變化及重組人生長激素調(diào)控作用的研究[D];山東大學(xué);2009年

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