發(fā)布時間：2020-11-03 08:40

　　 為了了解luxS基因和pfs基因變異情況,探索信號分子AI-2(Autoinducer-2,AI-2)體外合成的影響因素。本試驗應(yīng)用PCR法擴(kuò)增了奶牛隱性乳房炎致病性大腸桿菌E285的luxS和pfs基因,經(jīng)酶切后插入原核表達(dá)載體pET-30a(+)中,經(jīng)PCR和酶切鑒定后進(jìn)行序列測定及分析,構(gòu)建luxS和pfs基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-luxS和pET-pfs,經(jīng)誘導(dǎo)、純化獲得可溶性重組LuxS蛋白和Pfs蛋白,利用純化的重組蛋白LuxS和Pfs體外合成AI-2分子。結(jié)果表明,擴(kuò)增獲得的luxS基因和pfs基因高度保守,與GenBank中已發(fā)表的核苷酸序列同源性均達(dá)到98%以上;兩基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中均獲得了高效表達(dá),利用獲得重組蛋白LuxS和Pfs體外催化SAH,獲得了AI-2分子,其濃度為200μmol/L,對其活性檢測顯示為陰性對照DH5α的61倍。提示奶牛隱性乳房炎致病性大腸桿菌E285的LuxS和Pfs蛋白在體外能催化SAH產(chǎn)生高活性的AI-2。為深入研究AI-2對E285的毒力基因表達(dá)、生物被膜形成的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。
【部分圖文】：

以特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增luxS基因和pfs基因,結(jié)果顯示,擴(kuò)增到的條帶分別約為516 bp和690 bp,與目的條帶大小一致(圖1)。表明PCR擴(kuò)增到了目的片段。2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定結(jié)果顯示,2個重組質(zhì)粒均能擴(kuò)增到和目的片段大小相同的片段(圖2A)。重組質(zhì)粒pET-luxS分別用EcoR I、Hind III單酶切,均獲得了1條約5 938 bp條帶,與重組質(zhì)粒大小一致;用EcoR I和Hind III雙酶切得到1條約5 422 bp和1條516 bp兩條帶,小帶與目的基因luxS基因大小相同;pET-pfs分別用EcoR I、Hind III單酶切,均獲得了一條約6 112 bp條帶,與重組質(zhì)粒大小一致,用EcoR I和Hind III雙酶切得到1條約5 422 bp和1條690 bp兩條帶,小帶與目的基因pfs基因大小相同(圖2B、C)。PCR和酶切鑒定均證明重組質(zhì)粒pET-luxS和pET-pfs構(gòu)建成功。2.2.2 luxS基因和pfs基因序列測定

將表達(dá)純化的LuxS和Pfs蛋白免疫新西蘭大白兔獲得的多抗,通過Western Blot鑒定后,在相應(yīng)的位置出現(xiàn)了條帶(24 ku和30 ku)(圖4),與預(yù)期結(jié)果相符。圖4 重組蛋白LuxS和Pfs Western Blot 檢測及其純化產(chǎn)物的SDS-PAGE
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3 張婭;于丹妮;趙巍;李娜;韓育植;;luxS基因在變異鏈球菌鐵代謝中的作用研究[J];口腔醫(yī)學(xué);2013年04期

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5 張耀超;于丹妮;韓育植;;變異鏈球菌LuxS基因突變株生物被膜結(jié)構(gòu)的電鏡觀察[J];天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2009年04期

6 馬麗芳;倪龍興;童忠春;候波;楊帆;;變異鏈球菌LuxS基因表達(dá)載體的構(gòu)建[J];口腔醫(yī)學(xué);2008年04期

7 李月恒;陳惠珍;周智;陳嬌;李銳;尹一兵;張雪梅;;替代失活法構(gòu)建變形鏈球菌LuxS基因缺陷株[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2011年03期

8 王倩;白樺;黃正蔚;;大腸桿菌密度感應(yīng)缺陷株中LuxS的表達(dá)及其對生物膜形成的影響[J];口腔醫(yī)學(xué)研究;2014年03期

9 于丹妮;米媛;韓育植;;LuxS基因突變對變形鏈球菌生長的初步研究[J];河北醫(yī)藥;2009年21期

10 張耀超;陳杰;于丹妮;;LuxS基因缺失對變形鏈球菌蛋白表達(dá)的影響[J];透析與人工器官;2010年01期

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2 操敏;2型豬鏈球菌Al-2合成酶LuxS的功能鑒定及其在毒力中的作用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2012年

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6 張勇;蘇云金芽孢桿菌luxS基因的克隆表達(dá)及對植物抗病的影響[D];華中師范大學(xué);2004年

7 李月恒;變形鏈球菌LuxS基因缺陷株生物學(xué)性狀的初步研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

8 劉冰;黃連及其單體對S.suis生物被膜luxS基因及毒力因子的影響[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

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