本文關(guān)鍵詞：擬南芥脂肪族芥子油苷側(cè)鏈修飾酶基因的鑒定與分析

  更多相關(guān)文章： 擬南芥 脂肪族芥子油苷 黃素單氧化酶 次級(jí)修飾

【摘要】：芥子油苷是一種由氨基酸衍生而來的次級(jí)代謝產(chǎn)物,富含氮和硫等元素,在模式植物擬南芥和一些重要的蔬菜經(jīng)濟(jì)作物如白菜、西蘭花等十字花科植物中廣泛存在。芥子油苷主要分為吲哚族芥子油苷、脂肪族芥子油苷和芳香族芥子油苷。黑芥子酶是芥子油苷的水解酶,在植物體內(nèi)與芥子油苷互相隔離、同時(shí)存在,當(dāng)植物葉片遭受外界損傷時(shí)黑芥子酶與芥子油苷產(chǎn)生接觸,并將芥子油苷水解為一系列化學(xué)物質(zhì)。芥子油苷及其水解產(chǎn)物具有多種生物活性,可以幫助植物防御病原菌的侵染、抵御食草動(dòng)物和昆蟲的取食、參與調(diào)控植物生長素的合成,對(duì)人類也具有很好的抗腫瘤活性。其中,8-甲基亞磺酰辛基芥子油苷水解產(chǎn)生的異硫氰酸鹽對(duì)核盤菌有很強(qiáng)的毒性,4-甲基亞磺酰丁基芥子油苷的水解產(chǎn)物蘿卜硫素是目前已知的植物中最強(qiáng)的抗癌成分。因此,對(duì)芥子油苷生物合成的研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。脂肪族芥子油苷水解產(chǎn)物的生物活性與其側(cè)鏈的長度和結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。黃素單氧化酶FMO_(GS-OX)是脂肪族芥子油苷生物合成的側(cè)鏈修飾酶,催化側(cè)鏈的次級(jí)修飾,將甲基硫烷基芥子油苷(MT GSL)中的硫氧化生成甲基亞磺酰烷基芥子油苷(MS GSL)。目前,在FMO_(GS-OX)基因家族中已鑒定出5個(gè)側(cè)鏈修飾酶基因,為FMO_(GS-OX)1、FMO_(GS-OX)2、FMO_(GS-OX)3、FMO_(GS-OX)4、FMO_(GS-OX)5。根據(jù)生物信息學(xué)分析,At1g12130、At1g12160和At1g12200與上述5個(gè)基因親緣關(guān)系較近,且均被預(yù)測具有硫氧化活性,且可能參與脂肪族芥子油苷的側(cè)鏈氧化過程。因此將這三個(gè)基因作為FMO_(GS-OX)家族的候選基因。在本論文中,為了描述方便,暫將At1g12130命名為FMO_(GS-OX)6,將At1g12160命名為FMO_(GS-OX)7,將At1g12200命名為FMO_(GS-OX)8。為了驗(yàn)證這三個(gè)基因的功能,我們擬構(gòu)建該三個(gè)基因的過表達(dá)突變體,并通過商業(yè)途徑購買獲得基因功能缺失突變體,并進(jìn)行組織定位研究。本實(shí)驗(yàn)室已有部分前期工作基礎(chǔ),FMO_(GS-OX)6、FMO_(GS-OX)7基因的組織定位和FMO_(GS-OX)8的突變體構(gòu)建已經(jīng)完成。本論文在此基礎(chǔ)上繼續(xù)完成對(duì)三個(gè)基因的功能鑒定研究,主要研究結(jié)果如下:(1)獲得了FMO_(GS-OX)6、FMO_(GS-OX)7基因的過表達(dá)株系以p CAMBIA230035Su為基礎(chǔ),導(dǎo)入FMO_(GS-OX)6、FMO_(GS-OX)7的克隆片段,得到35::FMO_(GS-OX)6、35S::FMO_(GS-OX)7植物過表達(dá)載體,進(jìn)一步通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化和分子檢測獲得FMO_(GS-OX)6和FMO_(GS-OX)7的過量表達(dá)株系。(2)鑒定出2個(gè)新的擬南芥脂肪族芥子油苷側(cè)鏈修飾酶芥子油苷檢測結(jié)果顯示,與野生型相比,FMO_(GS-OX)6的過表達(dá)株系的種子中,MT:(MT+MS)有顯著降低,在葉片中無明顯變化;FMO_(GS-OX)7的過表達(dá)株系的葉片和種子中MT:(MT+MS)都有顯著的降低;在FMO_(GS-OX)6與FMO_(GS-OX)7的缺失突變體中芥子油苷表型無明顯變化,推測可能是由于其它FMO_(GS-OX)基因產(chǎn)生的冗余功能。上述結(jié)果表明,FMO_(GS-OX)6、FMO_(GS-OX)7能夠催化MT GSL,具有脂肪族芥子油苷側(cè)鏈修飾酶的功能。FMO_(GS-OX)8功能表現(xiàn)不明顯,不具備對(duì)MT GSL的催化功能。(3)明確了FMO_(GS-OX)8的表達(dá)模式FMO_(GS-OX)8基因在萌發(fā)期、成熟期表達(dá)水平較高,在新生幼葉中表達(dá)水平較高,在主葉脈、側(cè)根與主根交叉點(diǎn)、葉柄與下胚軸交叉點(diǎn)表達(dá)量較高。
【關(guān)鍵詞】：擬南芥 脂肪族芥子油苷 黃素單氧化酶 次級(jí)修飾
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q946
【目錄】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 前言12-24
• 1.1 芥子油苷概述12
• 1.2 芥子油苷代謝研究進(jìn)展12-17
• 1.2.1 芥子油苷生物合成研究進(jìn)展12-16
• 1.2.2 芥子油苷生物降解研究進(jìn)展16-17
• 1.3 芥子油苷及其降解產(chǎn)物的生物學(xué)功能17-19
• 1.3.1 防御作用17-18
• 1.3.2 抗癌活性18
• 1.3.3 參與調(diào)控生長素IAA的合成18-19
• 1.4 黃素單氧化酶FMO研究進(jìn)展19-22
• 1.4.1 黃素單氧化酶FMO概述19-20
• 1.4.2 擬南芥中黃素單氧化酶FMO研究進(jìn)展20
• 1.4.3 擬南芥中FMO_(GS-OX)基因研究進(jìn)展20-22
• 1.5 研究的目的與意義22
• 1.6 研究內(nèi)容與技術(shù)路線22-24
• 2 材料與方法24-37
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料24-26
• 2.1.1 植物材料24
• 2.1.2 菌株與質(zhì)粒24
• 2.1.3 生化試劑24
• 2.1.4 培養(yǎng)基24-25
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器25-26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法26-37
• 2.2.1 基因的生物信息學(xué)分析26
• 2.2.2 FMO_(GS-OX)6與FMO_(GS-OX)7基因克隆26-29
• 2.2.3 35S::FMO_(GS-OX)6和 35S:: FMO_(GS-OX)7植物表達(dá)載體的構(gòu)建29-31
• 2.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化31-32
• 2.2.5 轉(zhuǎn)基因植株的分子生物學(xué)檢測32-34
• 2.2.6 芥子油苷的提取和檢測34-35
• 2.2.7 FMO_(GS-OX)8基因的組織定位35-37
• 3 結(jié)果與分析37-54
• 3.1 FMO_(GS-OX)6和FMO_(GS-OX)7基因的生物信息學(xué)分析37-40
• 3.2 FMO_(GS-OX)6和FMO_(GS-OX)7基因的克隆40-41
• 3.3 35S::FMO_(GS-OX)6和 35S::FMO_(GS-OX)7植物表達(dá)載體的構(gòu)建41-42
• 3.4 35S::FMO_(GS-OX)6和 35S::FMO_(GS-OX)7轉(zhuǎn)基因擬南芥的構(gòu)建42-44
• 3.5 轉(zhuǎn)基因植株的分子生物學(xué)檢測44-46
• 3.5.1 轉(zhuǎn)基因植株中外源基因表達(dá)情況的PCR檢測44-45
• 3.5.2 轉(zhuǎn)基因植株中外源基因表達(dá)水平的RT-PCR檢測45-46
• 3.6 轉(zhuǎn)基因植株芥子油苷的檢測46-52
• 3.6.1 芥子油苷提取材料的鑒定46-48
• 3.6.2 35S::FMO_(GS-OX)6轉(zhuǎn)基因植株芥子油苷含量分析48-50
• 3.6.3 35S::FMO_(GS-OX)7轉(zhuǎn)基因植株芥子油苷含量分析50-51
• 3.6.4 35S::FMO_(GS-OX)8轉(zhuǎn)基因植株芥子油苷含量分析51-52
• 3.7 FMO_(GS-OX)8基因的組織定位分析52-54
• 4 討論54-56
• 4.1 FMO_(GS-OX)6功能的探討54
• 4.2 FMO_(GS-OX)7功能的探討54-55
• 4.3 FMO_(GS-OX)8功能的探討55
• 4.4 芥子油苷側(cè)鏈修飾與其生物活性的關(guān)系55-56
• 5 結(jié)論56-57
• 致謝57-58
• 參考文獻(xiàn)58-63
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文63

，

本文編號(hào)：992875