本文關(guān)鍵詞：藥用野生稻中淀粉合成酶基因家族的進化

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【摘要】：世界上近一半人口都以稻米為食,而稻米中最主要的成分就是淀粉,各國的科學(xué)家從基礎(chǔ)研究和應(yīng)用等領(lǐng)域?qū)λ镜矸鄣暮铣蛇^程和個體基因功能進行了大量的探索研究,為水稻優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、高抗做出了重要貢獻。對于控制淀粉合成的淀粉合成酶基因一直是科學(xué)研究關(guān)注的焦點,其重要性不言而喻。藥用野生稻(Oryza officinalis Wall.ex Watt)隸屬于禾本科(Poaceae),是世界上最重要的糧食作物——水稻(O.sativa L.)的親緣種,也是其遺傳改良的重要基因源。將藥用野生稻做為實驗對象進行深入研究,不但可以把握淀粉合成酶基因在同屬內(nèi)的自然進化規(guī)律,而且可以為水稻的遺傳育種和品質(zhì)改良提供必要的分子數(shù)據(jù)。鑒于此,本研究利用水稻基因組數(shù)據(jù),在全面挖掘栽培稻淀粉合成酶基因家族整體進化細(xì)節(jié)的基礎(chǔ)上,選取藥用野生稻作為植物材料,通過轉(zhuǎn)錄組測序、基因體外擴增和測序以及qRT-PCR基因表達(dá)定量等實驗手段,全面總結(jié)了藥用野生稻內(nèi)淀粉合成酶基因家族的基因構(gòu)成、序列特點以及表達(dá)分化等進化特點并探討了它們和栽培稻同源基因之間的具體差異。具體研究結(jié)果如下:一、利用第二代測序技術(shù),對藥用野生稻(O.officinalis)葉轉(zhuǎn)錄組進行了調(diào)查。結(jié)果獲得大約2.3×107個高質(zhì)量的讀條,每個讀條長100bp,總計約2.1×109個堿基長。采用De Novo方式重頭組裝出非冗余的單基因68132條,總長度約83Mbp。通過和NCBI、SWISS、KEGG、COG、GO和InterPro等數(shù)據(jù)庫內(nèi)數(shù)據(jù)的相似性比較,這些單基因的功能被進一步注釋。二、通過對栽培稻(O.sativa)全基因組的全面分析,發(fā)現(xiàn)水稻的淀粉合成酶基因家族共包括11個成員(SSI、SSII-1、SSII-2、SSII-3、SSIII-1、SSIII-2、SSIV-1、SSIV-2、SSV、GBSSI和GBSSII),分別定位在1、2、4-8和10號等8個染色體上,基因結(jié)構(gòu)各異,各包括8-20個外顯子,mRNA編碼長度在1827 bp-4662 bp之間變動。藥用野生稻的葉轉(zhuǎn)錄組中共有18728個讀條能夠順利匹配到11個栽培稻淀粉合成酶基因上,經(jīng)拼接,我們獲得了8個淀粉合成酶基因(SSI、SSII-1、SSII-2、SSIII-1、SSIII-2、SSIV-2、SSV和GBSSII)的完整編碼序列,這8個基因和它們栽培稻同源基因之間,在氨基酸序列水平的相似性均可以達(dá)到93%以上。此外,基于Ka/Ks的統(tǒng)計檢驗證明這8個基因在野生和栽培狀態(tài)均處于嚴(yán)格的純化之下。此外,有3個在栽培稻中出現(xiàn)的淀粉合成酶基因(SSII-3、SSIV-1和GBSSI)由于在藥用野生稻葉轉(zhuǎn)錄組中出現(xiàn)的讀條過少而未能成功拼接成完整基因,初步分析可能和這些基因在葉中表達(dá)水平偏低有關(guān)。三、根據(jù)已知的栽培稻、擬南芥、玉米和我們得到的藥用野生稻序列,我們構(gòu)建了最大似然性系統(tǒng)進化樹,結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個物種的淀粉合成酶基因完全按照基因功能進行聚類,藥用野生稻的8個基因全部置于不同功能分支內(nèi),顯示了我們基于轉(zhuǎn)錄組識別的淀粉合成酶基因的正確性。四、為了驗證藥用野生稻中淀粉合成酶各基因是否存在不同的表達(dá),我們根據(jù)藥用野生稻8個完整基因(SSI、SSII-1、SSII-2、SSIII-1、SSIII-2、SSIV-2、SSV和GBSSII)以及水稻3個淀粉合成酶基因(SSII-3、SSIV-1和GBSSI)的保守區(qū)設(shè)計mRNA引物,并分別在藥用野生稻的葉和種子兩個不同器官內(nèi)對這11個基因?qū)嵤┝艘幌盗衠RT-PCR實時定量操作。結(jié)果表明,淀粉合成酶基因家族不同成員的表達(dá)差異不但在相同器官,而且在不同器官間均有出現(xiàn)。例如GBSSI基因在不同器官間存在著明顯的時空特異表達(dá)現(xiàn)象,在葉中表達(dá)量較低,但在種子則高效表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：藥用野生稻 轉(zhuǎn)錄組 淀粉合成酶 基因家族
【學(xué)位授予單位】：曲阜師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 第一章 綜述9-20
• 1.1 淀粉簡介9-12
• 1.1.1 淀粉的結(jié)構(gòu)9-10
• 1.1.2 直鏈淀粉簡介10-11
• 1.1.3 支鏈淀粉簡介11-12
• 1.2 淀粉生物合成的相關(guān)酶12-16
• 1.2.1 顆粒結(jié)合型淀粉合成酶GBSS12-14
• 1.2.2 可溶性淀粉合成酶SSS14-16
• 1.2.3 淀粉分支酶SBE16
• 1.2.4 ADP焦磷酸化酶AGPase16
• 1.2.5 淀粉去分支酶SBE16
• 1.2.6 其它參與淀粉合成的酶16
• 1.3 藥用野生稻概述16-18
• 1.4 研究目的及意義18-20
• 第二章 實驗材料和方法20-27
• 2.1 植物材料的選取20
• 2.2 實驗方法20-26
• 2.2.1 植物總RNA的提取和文庫的構(gòu)建20
• 2.2.2 反轉(zhuǎn)錄cDNA的第一條鏈20-21
• 2.2.3 PCR擴增21-22
• 2.2.4 序列測定22-23
• 2.2.5 實時熒光定量PCR反應(yīng)及各項參數(shù)23-25
• 2.2.6 Real-time反應(yīng)條件的優(yōu)化25-26
• 2.3 實驗數(shù)據(jù)處理26-27
• 2.3.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝及功能注釋26
• 2.3.2 基因表達(dá)差異的計算26-27
• 第三章 藥用野生稻葉轉(zhuǎn)錄組測序分析及淀粉合成酶基因家族的識別27-41
• 3.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計27-32
• 3.1.1 應(yīng)用BLAST對轉(zhuǎn)錄組進行功能注釋28-29
• 3.1.2 基于GO（Gene Ontology）和InterPro的功能注釋29-30
• 3.1.3 通過InterPro預(yù)測蛋白功能30
• 3.1.4 COG功能分類和KEGG代謝途徑分類30-32
• 3.2 淀粉合成酶基因家族的識別32-41
• 3.2.1 栽培稻中淀粉合成酶基因家族32
• 3.2.2 栽培稻中淀粉合成酶基因的結(jié)構(gòu)32-34
• 3.2.3 轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)進行分析34
• 3.2.4 藥用野生稻淀粉合成酶基因組成和序列特點34-37
• 3.2.5 同源性與譜系關(guān)系分析37-39
• 3.2.6 討論39-41
• 第四章 淀粉合成酶基因家族基因表達(dá)及分析41-47
• 4.1 RNA純度和完整性分析41
• 4.2 淀粉合成酶基因家族相關(guān)基因的引物設(shè)計41-42
• 4.3 測序結(jié)果42
• 4.4 淀粉合成酶基因家族定量分析42-46
• 4.4.1 實時熒光定量PCR各項參數(shù)指標(biāo)42-44
• 4.4.2 淀粉合成酶基因家族在葉子中的的相對表達(dá)及分析44-45
• 4.4.3 淀粉合成酶基因家族在種子中的的相對表達(dá)及分析45-46
• 4.5 討論46-47
• 附錄47-49
• 參考文獻49-53
• 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及研究成果53-54
• 致謝54

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本文編號：991151