本文關(guān)鍵詞：外源香蕉枯萎病菌基因小分子RNA對其生長發(fā)育的影響

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【摘要】：香蕉枯萎病危害著我國和世界香蕉產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展,是亟待解決的世界性難題。寄主植物誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)是培育廣譜和持久抗病性的香蕉新種質(zhì)的有效途徑之一。前期通過對香蕉枯萎病菌早期發(fā)育蛋白質(zhì)組和24種營養(yǎng)親和型病原菌基因組的深入分析,發(fā)現(xiàn)麥角甾醇生物合成途徑Fo ERG6、Fo ERG11、Fo ERG13和Fo ERG25蛋白對病原菌的生長發(fā)育至關(guān)重要,是極佳的防控靶標(biāo)位點。其中Fo ERG6蛋白有兩個同源基因編碼即Fo ERG6A、Fo ERG6B,Fo ERG11蛋白有三個同源基因編碼即Fo ERG11A、Fo ERG11B、Fo ERG11C,Fo ERG13蛋白有三個同源基因編碼即Fo ERG13A、Fo ERG13B、Fo ERG13C,Fo ERG25蛋白有三個同源基因編碼即Fo ERG25A、Fo ERG25B、Fo ERG25C。本研究主要通過從體外外飼靶標(biāo)基因小分子RNA處理香蕉枯萎病菌熱帶四號生理小種(Foc TR4)和一號生理小種(Foc Race1),探索其抑菌效果及相關(guān)分子機理,為香蕉抗病分子育種提供理論依據(jù)。獲得如下結(jié)果:1.成功構(gòu)建了分別表達(dá)Foc TR4 ERG6、ERG11、ERG13和ERG25雙鏈RNA(ds RNA)的原核表達(dá)載體和香蕉遺傳轉(zhuǎn)化表達(dá)載體均以“正向片段+內(nèi)含子+反向片段的”的形式,將四個靶標(biāo)基因的特異干涉片段構(gòu)建了由prrn強啟動子驅(qū)動、能在大腸桿菌HT115(RNase III缺失體)中表達(dá)完整ds RNA的載體DI-T-P中;以及由Ubi強啟動子驅(qū)動,適合在香蕉中表達(dá)ds RNA的載體p YL-RNAi中。通過定量PCR檢測了陽性菌株中上述基因ds RNA的表達(dá)量;通過寄主植物誘導(dǎo)基因沉默技術(shù),獲得了含有Fo ERG6和Fo ERG11干涉片段的轉(zhuǎn)基因香蕉植株(由博士生竇同心完成)。2.四個靶標(biāo)蛋白編碼基因的ds RNA對Foc TR4和Foc Race1病原菌的早期發(fā)育都有顯著的抑制效果提取含靶標(biāo)基因ds RNA的陽性菌株總RNA,在體外對Foc TR4和Foc Race1進(jìn)行外飼處理,加入總RNA的濃度為500 ug/ul,孢子處理濃度為1×105 conidia/ml,分別在12、24和48小時時間點取樣觀察,發(fā)現(xiàn)四個靶標(biāo)基因的ds RNA對Foc TR4和Foc Race1早期發(fā)育均表現(xiàn)出顯著的抑制作用,其中Fo ERG11和Fo ERG25ds RNA的抑菌作用優(yōu)于Fo ERG6和Fo ERG13,并說明靶標(biāo)蛋白編碼基因序列在香蕉枯萎病菌中高度保守。3.經(jīng)靶標(biāo)基因ds RNA處理后Foc TR4中相應(yīng)的靶標(biāo)基因、麥角甾醇和膽固醇生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)譜變化Foc TR4經(jīng)靶標(biāo)基因ds RNA處理0和12小時后,運用定量PCR對靶標(biāo)基因、麥角甾醇和膽固醇生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)自身基因都顯著下調(diào),其他麥角甾醇途徑中的基因即ERG3A、ERG3B、ERG4、ERG6A、ERG6B、ERG11A、ERG11B、ERG11C、ERG13、ERG11A、ERG11B、ERG11C和ERG25均顯著下調(diào)表達(dá),膽固醇合成途徑中的基因即TGL、ARE1A和ARE1B均顯著上調(diào)表達(dá)。說明外飼靶標(biāo)蛋白編碼基因的ds RNA,都能有效抑制四個蛋白編碼的靶標(biāo)基因的表達(dá),同時也影響到了麥角甾醇生物合成途徑中其它基因和膽固醇合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)。4.高通量測序分析轉(zhuǎn)基因香蕉植株中小分子RNA的表達(dá)課題組其他成員運用寄主植物誘導(dǎo)基因沉默技術(shù),就是讓香蕉表達(dá)ds RNA來沉默入侵病菌細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)基因,以達(dá)到干擾病菌麥角甾醇生物合成、破壞其生物膜功能的目的。首先獲得了對香蕉枯萎病有一定廣譜抗性的新種質(zhì)RNAiFo ERG6和RNAi-Fo ERG11。本研究選擇野生型和四個不同轉(zhuǎn)基因株系(RNAi-ERG6-8、RNAi-ERG6-36、RNAi-ERG11-43、RNAi-ERG11-52)進(jìn)行小分子RNA測序分析,靶標(biāo)基因小分子RNA(si RNAs)的表達(dá)量占香蕉總量的1.96%、2.02%、5.47%和6.20%。此外,外飼含靶標(biāo)基因si RNA的轉(zhuǎn)基因香蕉汁液,也能有效抑制Foc TR4的早期發(fā)育。說明在轉(zhuǎn)基因香蕉異源表達(dá)枯萎病菌Foc TR4 Fo ERG6和Fo ERG11基因的si RNAs能顯著提高它們的抗病性。綜上所述,本研究證明Foc TR4的ERGs基因序列在香蕉枯萎病菌小種間非常保守;Foc TR4能夠吸收外飼的完整ds RNA和si RNA,并引發(fā)體內(nèi)的RNAi沉默機制;再次說明抑制香蕉枯萎病菌麥角甾醇生物合成途徑,干擾其生物膜功能,能有效抑制病原菌的生長。由于ERGs基因在香蕉枯萎病菌中高度保守,且為真菌特有代謝途徑的合成基因,寄主植物誘導(dǎo)基因沉默方法靶標(biāo)ERGs基因在香蕉抗病育種中具有很強的廣譜性和安全性。此結(jié)果為培育廣譜、持久抗病香蕉新種質(zhì)、解決生產(chǎn)實踐中抗病基因資源缺乏的問題開拓了新的策略。
【關(guān)鍵詞】：香蕉 Foc TR4 麥角甾醇 轉(zhuǎn)錄后基因沉默 dsRNA
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S436.68
【目錄】：

• 摘要3-5
• abstract5-8
• 縮略詞與英漢對照8-13
• 1 前言13-21
• 1.1 香蕉與香蕉枯萎病13
• 1.2 香蕉枯萎病的危害13-14
• 1.3 香蕉枯萎病的防治14-15
• 1.4 真菌麥角甾醇的生物合成途徑及本研究中相關(guān)目的基因15-19
• 1.4.1 本研究中相關(guān)目的基因的選擇18-19
• 1.5 基于高通量測序的香蕉小分子RNA分析19-20
• 1.6 研究目的及意義20-21
• 2 材料與方法21-39
• 2.1 實驗材料21
• 2.2 菌株與載體21-22
• 2.3 PCR擴增引物22-24
• 2.4 主要儀器設(shè)備24
• 2.5 主要試劑、藥品24-25
• 2.6 主要溶液及試劑配方25-26
• 2.6.1 1000×木村B營養(yǎng)母液25
• 2.6.2 細(xì)菌培養(yǎng)基25
• 2.6.3 Foc TR4培養(yǎng)基及培養(yǎng)基組成成分25
• 2.6.4 抗生素貯存液25-26
• 2.6.5 RNA抽提所需試劑26
• 2.7 生物信息學(xué)分析工具26
• 2.8 載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化26-29
• 2.8.1 目的片段的擴增26-27
• 2.8.2 目的片段的連接27
• 2.8.3 大腸桿菌熱激感受態(tài)細(xì)胞的制備27-28
• 2.8.4 熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌28
• 2.8.5 質(zhì)粒提取及陽性質(zhì)粒鑒定28
• 2.8.6 陽性克隆的序列測定與分析28
• 2.8.7 相關(guān)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化28-29
• 2.8.8 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和凍融轉(zhuǎn)化29
• 2.8.9 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性鑒定29
• 2.9 ds RNA的表達(dá)29-30
• 2.10 總RNA的提取30-31
• 2.10.1 Triol法大量提取大腸桿菌總RNA30
• 2.10.2 總RNA中基因組DNA的去除30-31
• 2.11 相關(guān)陽性菌株中m RNA的相對表達(dá)量31-32
• 2.11.1 反轉(zhuǎn)錄c DNA第一條鏈的合成31
• 2.11.2 大腸桿菌中四個靶基因編碼蛋白m RNA的相對表達(dá)量31-32
• 2.12 在體外靶標(biāo)蛋白編碼基因的ds RNA對病原菌的抑菌試驗32-33
• 2.12.1 病原菌Foc TR4及Foc Race 1 的培養(yǎng)分生孢子的獲得32
• 2.12.2 抑菌試驗處理方法32
• 2.12.3 抑菌試驗處理設(shè)計32
• 2.12.4 觀察方法32-33
• 2.13 麥角甾醇及膽固醇代謝途徑中相關(guān)基因的m RNA水平的表達(dá)分析33-34
• 2.13.1 Foc TR4菌體的獲得33
• 2.13.2 Foc TR4 m RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄成c DNA33
• 2.13.3 m RNA反轉(zhuǎn)錄成c DNA33
• 2.13.4 熒光定量PCR檢測相關(guān)基因的表達(dá)。33-34
• 2.14 轉(zhuǎn)基因香蕉小分子RNA的測序分析34-37
• 2.14.1 RNAi-Fo ERG6和RNAi-Fo ERG11轉(zhuǎn)基因香蕉材料的檢測34-35
• 2.14.2 測序轉(zhuǎn)基因香蕉小分子RNA材料的獲得35
• 2.14.3 小分子RNA的高通量測序35-37
• 2.14.4 生物信息學(xué)分析測序結(jié)果37
• 2.15 Foc TR4對轉(zhuǎn)基因香蕉中靶基因si RNA吸收的效果檢測37-38
• 2.15.1 香蕉葉片汁液的提取37-38
• 2.15.2 體外液體抑菌試驗38
• 2.15.3 拍照處理38
• 2.16 數(shù)據(jù)處理與分析38-39
• 3 結(jié)果與分析39-62
• 3.1 香蕉枯萎病菌中四個靶標(biāo)蛋白編碼基因的生物信息學(xué)分析39
• 3.1.1 四個靶標(biāo)蛋白編碼干涉片段的選取39
• 3.2 相關(guān)載體的構(gòu)建39-43
• 3.2.1 香蕉遺傳轉(zhuǎn)化表達(dá)載體的構(gòu)建39-41
• 3.2.2 組成型原核表達(dá)載體的構(gòu)建41-43
• 3.3 大腸桿菌HT115菌株中四個靶標(biāo)蛋白編碼基因的ds RNA水平檢測43-44
• 3.4 Foc TR4及Foc race1早期發(fā)育的抑菌試驗44-48
• 3.4.1 四個基因的ds RNA處理Foc TR4的結(jié)果展示44-46
• 3.4.2 四個靶標(biāo)蛋白編碼基因的ds RNA處理Foc Race 146-48
• 3.5 麥角甾醇及膽固醇代謝途徑中相關(guān)基因的m RNA水平的表達(dá)分析48-53
• 3.6 轉(zhuǎn)基因香蕉中小分子RNA測序53-58
• 3.6.1 轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因香蕉材料的檢測53
• 3.6.2 測序材料的獲得及Foc TR4侵染根后的表型53-54
• 3.6.3 小分子RNA測序分析54-58
• 3.7 Foc TR4對轉(zhuǎn)基因香蕉中靶基因si RNA吸收的效果檢測58-62
• 4 討論62-66
• 4.1 抑菌試驗及麥角甾醇生物合成途徑中相關(guān)基因分析62-64
• 4.2 小分子RNA在植物生長發(fā)育中的重要性64
• 4.3 宿主誘導(dǎo)的基因沉默64-66
• 致謝66-67
• 參考文獻(xiàn)67-72

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本文編號：986533