本文關(guān)鍵詞：石斑魚(yú)趨化因子和趨化因子受體基因鑒定及功能初步研究

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【摘要】：趨化因子和趨化因子受體通過(guò)其相互作用介導(dǎo)了機(jī)體免疫系統(tǒng)由先天性到獲得性免疫的轉(zhuǎn)變,在免疫系統(tǒng)中具有重要的地位。同時(shí),趨化因子受體能激活多種信號(hào)通路,對(duì)細(xì)胞的增殖、存活、凋亡等生理活動(dòng)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。大量研究證明了刺激隱核蟲(chóng)可引起魚(yú)類(lèi)的先天性和獲得性免疫反應(yīng),而本課題組前期研究顯示趨化因子系統(tǒng)可能參與宿主抗刺激隱核蟲(chóng)免疫應(yīng)答,但具體的作用機(jī)制尚不清楚。為闡明趨化因子系統(tǒng)在宿主抗刺激隱核蟲(chóng)中的作用,本文基于斜帶石斑魚(yú)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)得到的趨化因子和受體基因的EST(Expressed Sequence Tag)序列,克隆獲得了2個(gè)趨化因子和8個(gè)趨化因子受體基因序列,并通過(guò)熒光定量PCR對(duì)這些基因在刺激隱核蟲(chóng)感染前后的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況進(jìn)行了分析。此外,還構(gòu)建了趨化因子和多個(gè)趨化因子受體的真核表達(dá)重組質(zhì)粒,并制備了趨化因子受體XCR1-3的多抗,最后,通過(guò)熒光素酶雙報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)研究了趨化因子受體信號(hào)通路對(duì)NF-κB的調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)主要結(jié)果如下:(1)論文克隆獲得了斜帶石斑魚(yú)趨化因子CCL25和CXCL12-2,以及趨化因子受體CCR9-1、CCR9-2、CXCR3、CXCR4-2、CXCR7、XCR1-1、XCR1-2和XCR1-3的序列,其ORF區(qū)的長(zhǎng)度分別為324 bp、309 bp、1119 bp、1125 bp、1110 bp、1152 bp、1137 bp、1011 bp、1044 bp和1074 bp。進(jìn)化分析表明克隆得到的趨化因子和受體基因編碼氨基酸序列均與相對(duì)應(yīng)的魚(yú)類(lèi)同源序列有較高的同源性;(2)熒光定量PCR結(jié)果顯示,在健康石斑魚(yú)組織中,CCL25、CXCR4-2、CCR9-1、CCR9-2、XCR1-1、XCR1-2和XCR1-3等基因主要在免疫組織上表達(dá),其中,CXCR4-2在頭腎中表達(dá)量最高,CCL25、CCR9-1和CCR9-2在胸腺中表達(dá)量最高;而刺激隱核蟲(chóng)感染后的表達(dá)譜分析顯示CCL25、CXCL12-2、CXCR4-2、XCR1-1、XCR1-2和XCR1-3的在感染部位——皮膚和鰓的表達(dá)量均表現(xiàn)出一定程度的上調(diào),其中CCL25、CXCL12-2、XCR1-1、XCR1-2和XCR1-3變化顯著,CCL25、CXCL12-2、CCR9-1、CXCR3、CXCR4-2、XCR1-1、XCR1-2和XCR1-3在造血組織——頭腎和脾臟中均表現(xiàn)為上調(diào),暗示了相關(guān)免疫細(xì)胞的增殖;(3)論文表達(dá)了CCL25、CXCL12-2和XCR1-3融合蛋白,為下一步開(kāi)展趨化功能研究奠定了基礎(chǔ),此外,利用重組表達(dá)的XCR1-3蛋白制備了多克隆抗體,并成功標(biāo)記了石斑魚(yú)外周血XCR1-3+細(xì)胞,為開(kāi)展XCR1-3+細(xì)胞的組織分布及抗病功能研究提供工具;(4)論文構(gòu)建了CCL25和CXCL12候選受體的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-HA-CCR9-1、CCR9-2、CXCR4-2和CXCR7,這四個(gè)重組質(zhì)粒在HEK293T和CLC細(xì)胞系中均能表達(dá)。在HEK293T細(xì)胞系中,四個(gè)趨化因子受體重組真核表達(dá)質(zhì)粒均表現(xiàn)出抑制NF-κB的活性,但抑制效果不顯著。而在CLC細(xì)胞系中,CCR9-1、CCR9-2和CXCR4-2對(duì)NF-κB的活性仍起著抑制作用,其中,CCR9-2和CXCR4-2抑制效果顯著,而CXCR7卻能顯著激活NF-κB的活性,而相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。
【關(guān)鍵詞】：石斑魚(yú) 趨化因子 趨化因子受體 刺激隱核蟲(chóng)
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 英文縮略詞7-10
• 1 前言10-25
• 1.1 魚(yú)類(lèi)的免疫系統(tǒng)10-15
• 1.2 趨化因子和趨化因子受體概況15-21
• 1.3 魚(yú)類(lèi)趨化因子和趨化因子受體研究進(jìn)展21-22
• 1.4 刺激隱核蟲(chóng)及其免疫學(xué)研究進(jìn)展22-24
• 1.5 研究的目的和意義24-25
• 2 趨化因子和趨化因子受體基因的克隆與序列分析25-42
• 2.1 材料25-26
• 2.2 試驗(yàn)方法26-30
• 2.3 結(jié)果與分析30-39
• 2.4 討論39-40
• 2.5 小結(jié)40-42
• 3 趨化因子和趨化因子受體基因的表達(dá)譜分析42-51
• 3.1 材料42-43
• 3.2 試驗(yàn)方法43-44
• 3.3 結(jié)果與分析44-48
• 3.4 討論48-49
• 3.5 小結(jié)49-51
• 4 趨化因子和趨化因子受體功能初步研究51-71
• 4.1 材料51-54
• 4.2 試驗(yàn)方法54-62
• 4.3 結(jié)果與分析62-68
• 4.4 討論68-70
• 4.5 小結(jié)70-71
• 全文總結(jié)71-72
• 致謝72-73
• 參考文獻(xiàn)73-82

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