本文關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒G1與G2基因亞型毒株抗原差異性分析

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【摘要】：豬流行性腹瀉病毒(PEDV)是一種通過小腸感染,引起豬嘔吐、腹瀉、脫水的急性高度接觸性傳染病。2010年起在我國迅速爆發(fā),對仔豬的致死率高達80%-100%。雖然弱毒疫苗與滅活疫苗對PEDV的流行起到一定的控制作用,但PEDV仍在我國廣泛存在,對養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。PEDV可分為G1與G2基因亞型,兩亞型間可誘導機體產(chǎn)生中和抗體的病毒纖突(Spike,S)蛋白氨基酸序列存在缺失、插入和大量點突變。為進一步研究S蛋白序列的變異是否造成病毒抗原性的差異,本課題選取PEDV G1亞型CV777疫苗株與G2亞型LNCT2流行株,對其S基因進行密碼子優(yōu)化,利用真核表達系統(tǒng)建立一種表達和純化重組S蛋白的方法。重組S蛋白免疫小鼠血清中IgG抗體水平顯著升高。用所制備抗S蛋白多克隆抗體(Polyclonal antibody,PAb)與不同亞型毒株進行間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、間接免疫熒光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)、Western blot、交叉中和試驗(Serum neutralization,SN)分析抗原差異性。ELISA結(jié)果顯示抗S蛋白PAb與同型S蛋白反應效價可達1:204800,與不同型S蛋白反應效價為1:102400。IFA結(jié)果表明抗S蛋白PAb針對同型毒株反應產(chǎn)生熒光時抗體最大稀釋倍數(shù)為1:51200,針對不同型毒株反應產(chǎn)生熒光抗體最大稀釋倍數(shù)為1:25600。SN結(jié)果為抗CV777 S蛋白PAb中和CV777毒株的平均效價為1:336,交叉中和LNCT2毒株的效價為1:150;抗LNCT2 S蛋白PAb中和LNCT2毒株的平均效價為1:387,而交叉中和CV777毒株的效價為1:230。結(jié)果表明不同亞型毒株間雖具有較強的交叉保護性,但PEDV S蛋白序列的變異使G1、G2亞型毒株產(chǎn)生了一定的抗原差異。為進一步探究G1與G2亞型S蛋白產(chǎn)生抗原性差異的關(guān)鍵區(qū)域,本課題篩選出5株S蛋白單克隆抗體(Monoclonal antibody,MAb),均可識別天然病毒中S蛋白。其中L5F7株MAb只與LNCT2毒株反應而不與CV777毒株反應,可用于鑒別G1與G2亞型毒株。利用截短表達蛋白方式初步鑒定其表位區(qū)位于S蛋白N端1-234位氨基酸(aa)之間,為構(gòu)象表位。通過對S蛋白氨基酸序列比對后發(fā)現(xiàn),G1與G2亞型S蛋白在S1區(qū)21-402aa間高度變異,應用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達CV777、LNCT2株S121-402aa蛋白并制備PAb,進行ELISA、IFA、SN等試驗,結(jié)果表明S121-402aa PAb與不同型毒株的反應效價差異不顯著,從而證明S121-402aa蛋白序列的高度變異并未產(chǎn)生明顯的抗原性差異。本課題以PEDV S蛋白為研究重點,證實G1與G2基因亞型病毒在分子水平與抗原性上均發(fā)生變異,并初步分析產(chǎn)生抗原性變異的關(guān)鍵區(qū)域,為了解PEDV在我國的遺傳變異情況,對現(xiàn)有疫苗的評價,新疫苗的篩選和研制提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：豬流行性腹瀉病毒 S蛋白 CV777 LNCT2 抗原性差異
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 第一章 引言13-20
• 1.1 豬流行性腹瀉病毒概述13-15
• 1.1.1 PEDV的分類13
• 1.1.2 PEDV基因組與結(jié)構(gòu)13-14
• 1.1.3 PEDV結(jié)構(gòu)蛋白14-15
• 1.2 PEDV近十年(2006-2015)流行情況15-17
• 1.2.1 歐美流行情況15
• 1.2.2 亞洲流行情況15
• 1.2.3 中國流行情況15-16
• 1.2.4 我國PEDV遺傳變異分析16-17
• 1.3 疫苗及研究進展17
• 1.4 PEDV S蛋白受體與抗原性研究進展17-19
• 1.4.1 PEDV受體研究進展17-18
• 1.4.2 PEDV S蛋白抗原性研究進展18-19
• 1.5 研究的目的和意義19-20
• 第二章 PEDV G1與G2亞型毒株S蛋白抗原差異性分析20-32
• 2.1 材料20-21
• 2.1.1 毒株、細胞、實驗動物與質(zhì)粒20
• 2.1.2 主要儀器與設備20
• 2.1.3 主要試劑與溶液20-21
• 2.2 方法21-25
• 2.2.1 CV777、LNCT2毒株S蛋白密碼子優(yōu)化21
• 2.2.2 優(yōu)化S基因真核表達載體的構(gòu)建21-23
• 2.2.3 重組CV777、LNCT2 S蛋白的表達23
• 2.2.4 重組CV777、LNCT2 S蛋白的純化23-24
• 2.2.5 CV777、LNCT2 S蛋白多克隆抗體的制備24
• 2.2.6 免疫小鼠血清中IgG抗體的檢測24
• 2.2.7 間接免疫熒光試驗24
• 2.2.8 Western blot分析24
• 2.2.9 交叉中和試驗24-25
• 2.3 結(jié)果25-30
• 2.3.1 CV777、LNCT2 S基因密碼子優(yōu)化25
• 2.3.2 重組真核表達載體的構(gòu)建25
• 2.3.3 重組CV777、LNCT2 S蛋白的表達與純化25-27
• 2.3.4 S蛋白免疫小鼠血清IgG抗體含量變化27-28
• 2.3.5 間接ELISA評價G1、G2亞型S蛋白間抗原差異性28
• 2.3.6 間接免疫熒光評價G1、G2亞型毒株抗原差異性28-29
• 2.3.7 Western blot評價G1、G2亞型毒株抗原差異性29-30
• 2.3.8 中和試驗評價G1、G2亞型毒株抗原差異性30
• 2.4 討論30-32
• 第三章 PEDV S蛋白單克隆抗體的制備及差異性抗原表位初步篩選32-40
• 3.1 材料32-33
• 3.1.1 毒株、細胞32
• 3.1.2 主要儀器與設備32
• 3.1.3 主要試劑與溶液32-33
• 3.2 方法33-35
• 3.2.1 CV777、LNCT2株S蛋白單克隆抗體的制備33-34
• 3.2.2 PEDV S蛋白單克隆抗體免疫活性的鑒定34-35
• 3.2.3 單克隆抗體亞型特異性檢測35
• 3.2.4 LNCT2株病毒特異性單克隆抗體L5F7抗原表位初步鑒定35
• 3.3 結(jié)果35-39
• 3.3.1 單克隆抗體效價的測定35-36
• 3.3.2 單克隆抗體亞型鑒定36
• 3.3.3 單克隆抗體Western blot鑒定36
• 3.3.4 單克隆抗體IFA鑒定36-37
• 3.3.5 單克隆抗體中和活性的鑒定37
• 3.3.6 LNCT2特異性單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)37-38
• 3.3.7 L5F7株MAb抗原表位的初步鑒定38-39
• 3.4 討論39-40
• 第四章 PEDV G1與G2基因亞型S蛋白高變區(qū)抗原差異性分析40-50
• 4.1 材料40-41
• 4.1.1 毒株、細胞、質(zhì)粒與實驗動物40
• 4.1.2 主要儀器與設備40
• 4.1.3 主要試劑與溶液40-41
• 4.2 方法41-44
• 4.2.1 PEDV G1與G2亞型S蛋白高變區(qū)序列分析41
• 4.2.2 S61-1206bp基因重組載體的構(gòu)建41-42
• 4.2.3 重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-CV777 S1，Bacmid-LNCT2 S1的制備與鑒定42-43
• 4.2.4 重組桿狀病毒的拯救43
• 4.2.5 重組S121-402aa蛋白的表達、純化與多克隆抗體的制備43
• 4.2.6 間接ELISA檢測S1高變區(qū)抗原差異性43
• 4.2.7 IFA檢測S1高變區(qū)抗原差異性43-44
• 4.2.8 中和試驗檢測S1高變區(qū)抗原差異性44
• 4.3 結(jié)果44-48
• 4.3.1 PEDV G1與G2亞型S蛋白高變區(qū)序列分析44
• 4.3.2 S61-1206bp基因的擴增與重組質(zhì)粒的鑒定44-45
• 4.3.3 重組Bacmid與重組桿狀病毒的鑒定45-46
• 4.3.4 重組PEDV S121-402aa蛋白表達與純化46-47
• 4.3.5 間接ELISA評價G1、G2亞型S1高變區(qū)抗原差異性47-48
• 4.3.6 IFA、中和試驗評價G1、G2亞型S1高變區(qū)抗原差異性48
• 4.4 討論48-50
• 第五章 全文結(jié)論50-51
• 參考文獻51-57
• 附錄57-59
• 致謝59-60
• 作者簡介60

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本文編號：963184