本文關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒G1與G2基因亞型毒株抗原差異性分析

  更多相關(guān)文章： 豬流行性腹瀉病毒 S蛋白 CV777 LNCT2 抗原性差異

【摘要】：豬流行性腹瀉病毒(PEDV)是一種通過小腸感染,引起豬嘔吐、腹瀉、脫水的急性高度接觸性傳染病。2010年起在我國(guó)迅速爆發(fā),對(duì)仔豬的致死率高達(dá)80%-100%。雖然弱毒疫苗與滅活疫苗對(duì)PEDV的流行起到一定的控制作用,但PEDV仍在我國(guó)廣泛存在,對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。PEDV可分為G1與G2基因亞型,兩亞型間可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的病毒纖突(Spike,S)蛋白氨基酸序列存在缺失、插入和大量點(diǎn)突變。為進(jìn)一步研究S蛋白序列的變異是否造成病毒抗原性的差異,本課題選取PEDV G1亞型CV777疫苗株與G2亞型LNCT2流行株,對(duì)其S基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化,利用真核表達(dá)系統(tǒng)建立一種表達(dá)和純化重組S蛋白的方法。重組S蛋白免疫小鼠血清中IgG抗體水平顯著升高。用所制備抗S蛋白多克隆抗體(Polyclonal antibody,PAb)與不同亞型毒株進(jìn)行間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、間接免疫熒光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)、Western blot、交叉中和試驗(yàn)(Serum neutralization,SN)分析抗原差異性。ELISA結(jié)果顯示抗S蛋白PAb與同型S蛋白反應(yīng)效價(jià)可達(dá)1:204800,與不同型S蛋白反應(yīng)效價(jià)為1:102400。IFA結(jié)果表明抗S蛋白PAb針對(duì)同型毒株反應(yīng)產(chǎn)生熒光時(shí)抗體最大稀釋倍數(shù)為1:51200,針對(duì)不同型毒株反應(yīng)產(chǎn)生熒光抗體最大稀釋倍數(shù)為1:25600。SN結(jié)果為抗CV777 S蛋白PAb中和CV777毒株的平均效價(jià)為1:336,交叉中和LNCT2毒株的效價(jià)為1:150;抗LNCT2 S蛋白PAb中和LNCT2毒株的平均效價(jià)為1:387,而交叉中和CV777毒株的效價(jià)為1:230。結(jié)果表明不同亞型毒株間雖具有較強(qiáng)的交叉保護(hù)性,但PEDV S蛋白序列的變異使G1、G2亞型毒株產(chǎn)生了一定的抗原差異。為進(jìn)一步探究G1與G2亞型S蛋白產(chǎn)生抗原性差異的關(guān)鍵區(qū)域,本課題篩選出5株S蛋白單克隆抗體(Monoclonal antibody,MAb),均可識(shí)別天然病毒中S蛋白。其中L5F7株MAb只與LNCT2毒株反應(yīng)而不與CV777毒株反應(yīng),可用于鑒別G1與G2亞型毒株。利用截短表達(dá)蛋白方式初步鑒定其表位區(qū)位于S蛋白N端1-234位氨基酸(aa)之間,為構(gòu)象表位。通過對(duì)S蛋白氨基酸序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn),G1與G2亞型S蛋白在S1區(qū)21-402aa間高度變異,應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)CV777、LNCT2株S121-402aa蛋白并制備PAb,進(jìn)行ELISA、IFA、SN等試驗(yàn),結(jié)果表明S121-402aa PAb與不同型毒株的反應(yīng)效價(jià)差異不顯著,從而證明S121-402aa蛋白序列的高度變異并未產(chǎn)生明顯的抗原性差異。本課題以PEDV S蛋白為研究重點(diǎn),證實(shí)G1與G2基因亞型病毒在分子水平與抗原性上均發(fā)生變異,并初步分析產(chǎn)生抗原性變異的關(guān)鍵區(qū)域,為了解PEDV在我國(guó)的遺傳變異情況,對(duì)現(xiàn)有疫苗的評(píng)價(jià),新疫苗的篩選和研制提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：豬流行性腹瀉病毒 S蛋白 CV777 LNCT2 抗原性差異
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 第一章 引言13-20
• 1.1 豬流行性腹瀉病毒概述13-15
• 1.1.1 PEDV的分類13
• 1.1.2 PEDV基因組與結(jié)構(gòu)13-14
• 1.1.3 PEDV結(jié)構(gòu)蛋白14-15
• 1.2 PEDV近十年(2006-2015)流行情況15-17
• 1.2.1 歐美流行情況15
• 1.2.2 亞洲流行情況15
• 1.2.3 中國(guó)流行情況15-16
• 1.2.4 我國(guó)PEDV遺傳變異分析16-17
• 1.3 疫苗及研究進(jìn)展17
• 1.4 PEDV S蛋白受體與抗原性研究進(jìn)展17-19
• 1.4.1 PEDV受體研究進(jìn)展17-18
• 1.4.2 PEDV S蛋白抗原性研究進(jìn)展18-19
• 1.5 研究的目的和意義19-20
• 第二章 PEDV G1與G2亞型毒株S蛋白抗原差異性分析20-32
• 2.1 材料20-21
• 2.1.1 毒株、細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與質(zhì)粒20
• 2.1.2 主要儀器與設(shè)備20
• 2.1.3 主要試劑與溶液20-21
• 2.2 方法21-25
• 2.2.1 CV777、LNCT2毒株S蛋白密碼子優(yōu)化21
• 2.2.2 優(yōu)化S基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建21-23
• 2.2.3 重組CV777、LNCT2 S蛋白的表達(dá)23
• 2.2.4 重組CV777、LNCT2 S蛋白的純化23-24
• 2.2.5 CV777、LNCT2 S蛋白多克隆抗體的制備24
• 2.2.6 免疫小鼠血清中IgG抗體的檢測(cè)24
• 2.2.7 間接免疫熒光試驗(yàn)24
• 2.2.8 Western blot分析24
• 2.2.9 交叉中和試驗(yàn)24-25
• 2.3 結(jié)果25-30
• 2.3.1 CV777、LNCT2 S基因密碼子優(yōu)化25
• 2.3.2 重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建25
• 2.3.3 重組CV777、LNCT2 S蛋白的表達(dá)與純化25-27
• 2.3.4 S蛋白免疫小鼠血清IgG抗體含量變化27-28
• 2.3.5 間接ELISA評(píng)價(jià)G1、G2亞型S蛋白間抗原差異性28
• 2.3.6 間接免疫熒光評(píng)價(jià)G1、G2亞型毒株抗原差異性28-29
• 2.3.7 Western blot評(píng)價(jià)G1、G2亞型毒株抗原差異性29-30
• 2.3.8 中和試驗(yàn)評(píng)價(jià)G1、G2亞型毒株抗原差異性30
• 2.4 討論30-32
• 第三章 PEDV S蛋白單克隆抗體的制備及差異性抗原表位初步篩選32-40
• 3.1 材料32-33
• 3.1.1 毒株、細(xì)胞32
• 3.1.2 主要儀器與設(shè)備32
• 3.1.3 主要試劑與溶液32-33
• 3.2 方法33-35
• 3.2.1 CV777、LNCT2株S蛋白單克隆抗體的制備33-34
• 3.2.2 PEDV S蛋白單克隆抗體免疫活性的鑒定34-35
• 3.2.3 單克隆抗體亞型特異性檢測(cè)35
• 3.2.4 LNCT2株病毒特異性單克隆抗體L5F7抗原表位初步鑒定35
• 3.3 結(jié)果35-39
• 3.3.1 單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定35-36
• 3.3.2 單克隆抗體亞型鑒定36
• 3.3.3 單克隆抗體Western blot鑒定36
• 3.3.4 單克隆抗體IFA鑒定36-37
• 3.3.5 單克隆抗體中和活性的鑒定37
• 3.3.6 LNCT2特異性單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)37-38
• 3.3.7 L5F7株MAb抗原表位的初步鑒定38-39
• 3.4 討論39-40
• 第四章 PEDV G1與G2基因亞型S蛋白高變區(qū)抗原差異性分析40-50
• 4.1 材料40-41
• 4.1.1 毒株、細(xì)胞、質(zhì)粒與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40
• 4.1.2 主要儀器與設(shè)備40
• 4.1.3 主要試劑與溶液40-41
• 4.2 方法41-44
• 4.2.1 PEDV G1與G2亞型S蛋白高變區(qū)序列分析41
• 4.2.2 S61-1206bp基因重組載體的構(gòu)建41-42
• 4.2.3 重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-CV777 S1，Bacmid-LNCT2 S1的制備與鑒定42-43
• 4.2.4 重組桿狀病毒的拯救43
• 4.2.5 重組S121-402aa蛋白的表達(dá)、純化與多克隆抗體的制備43
• 4.2.6 間接ELISA檢測(cè)S1高變區(qū)抗原差異性43
• 4.2.7 IFA檢測(cè)S1高變區(qū)抗原差異性43-44
• 4.2.8 中和試驗(yàn)檢測(cè)S1高變區(qū)抗原差異性44
• 4.3 結(jié)果44-48
• 4.3.1 PEDV G1與G2亞型S蛋白高變區(qū)序列分析44
• 4.3.2 S61-1206bp基因的擴(kuò)增與重組質(zhì)粒的鑒定44-45
• 4.3.3 重組Bacmid與重組桿狀病毒的鑒定45-46
• 4.3.4 重組PEDV S121-402aa蛋白表達(dá)與純化46-47
• 4.3.5 間接ELISA評(píng)價(jià)G1、G2亞型S1高變區(qū)抗原差異性47-48
• 4.3.6 IFA、中和試驗(yàn)評(píng)價(jià)G1、G2亞型S1高變區(qū)抗原差異性48
• 4.4 討論48-50
• 第五章 全文結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-57
• 附錄57-59
• 致謝59-60
• 作者簡(jiǎn)介60

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李力;楊東靖;蘇旭;;漢坦病毒G1糖蛋白畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建[J];環(huán)境與健康雜志;2012年11期

2 常艷梅;陳義華;;基于指數(shù)標(biāo)度的G1法及其應(yīng)用[J];重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué));2013年08期

3 王學(xué)軍;郭亞軍;;基于G1法的判斷矩陣的一致性分析[J];中國(guó)管理科學(xué);2006年03期

4 李剛;張明;宋兆杰;程硯秋;;基于標(biāo)準(zhǔn)差修正G1組合賦權(quán)的科技評(píng)價(jià)模型及實(shí)證[J];科技管理研究;2011年20期

5 石偉,朱立平,崔蓮仙,張淑珍,王汛,李國(guó)燕;用單抗5C5和5C5-G1篩選的613bp cDNA的核苷酸序列分析[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;1996年02期

6 遲國(guó)泰;閆達(dá)文;;基于改進(jìn)群組G1賦權(quán)的生態(tài)評(píng)價(jià)模型及省份實(shí)證[J];系統(tǒng)工程理論與實(shí)踐;2012年07期

7 李剛;王斌;周立斌;張明;陳凱;;基于標(biāo)準(zhǔn)差修正G1組合賦權(quán)的人的全面發(fā)展評(píng)價(jià)模型及實(shí)證[J];系統(tǒng)工程理論與實(shí)踐;2012年11期

8 徐亮;;iPhone最強(qiáng)大的對(duì)手Google手機(jī)G1[J];科學(xué)24小時(shí);2009年01期

9 佟志剛;孫輝;;定血塞通膠囊中人參皂苷R_(g1)、R_(b1)和三七皂苷R_1的含量測(cè)定[J];黑龍江科技信息;2011年12期

10 詹萍;邱冬紅;;紅樹林細(xì)菌G1產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)發(fā)酵條件的優(yōu)化[J];生物技術(shù);2012年06期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 張祥宏;申海濤;呂平;邢欣;左連富;嚴(yán)霞;邢凌霄;王俊靈;;支氣管給予黃曲霉毒素G1對(duì)大鼠肺組織Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的影響[A];全國(guó)腫瘤流行病學(xué)和腫瘤病因?qū)W學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

2 林燕;劉霓紅;張維軍;徐樹蘭;童鐵鋼;徐青元;田野;馬健男;周東坡;吳東來;;赤羽病病毒G1蛋白單克隆抗體的制備及生物學(xué)活性分析[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)病理學(xué)分會(huì)第十六次學(xué)術(shù)研討會(huì)、中國(guó)病理生理學(xué)會(huì)動(dòng)物病理生理專業(yè)委員會(huì)第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

3 牟丹蕾;王平忠;李光玉;潘蕾;張巖;徐哲;李新紅;張野;黃長(zhǎng)形;白雪帆;;漢灘病毒G1蛋白胞質(zhì)區(qū)ITAM樣基序與Syk相互作用的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)全國(guó)第九次感染病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 本報(bào)記者 李響;G1打開手機(jī)開放之門[N];計(jì)算機(jī)世界;2008年

2 曹敏潔;谷歌首款手機(jī)G1劍指iPhone[N];東方早報(bào);2008年

3 四川 李其;索尼G1新概念數(shù)碼相機(jī)[N];電子報(bào);2007年

4 大地期貨 倪官良;人民幣：美國(guó)“G1”路上的又一絆腳石？[N];期貨日?qǐng)?bào);2010年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉景麗;環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（雙酚A）對(duì)小鼠糖穩(wěn)態(tài)及胰島功能的影響及機(jī)制[D];南京醫(yī)科大學(xué);2013年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 王瀟博;豬流行性腹瀉病毒G1與G2基因亞型毒株抗原差異性分析[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

2 陳瑩穎;基于G1-猶豫模糊評(píng)價(jià)方法的互聯(lián)網(wǎng)金融軟實(shí)力評(píng)價(jià)[D];華南理工大學(xué);2015年

3 劉霞;香蕉枯萎病生防菌白g1的拮抗機(jī)理及防治效果的初步研究[D];廣東海洋大學(xué);2010年

，

本文編號(hào)：963184