發(fā)布時間：2017-10-03 01:17

  本文關(guān)鍵詞：西瓜枯萎病菌FoCdk7、FoCdk9、FoCdk10和FoNot2基因在致病性中的功能研究

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【摘要】：由尖孢鐮刀菌西瓜�；�(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)侵染引起的西瓜枯萎病,是西瓜上的一種重要真菌病害,嚴(yán)重威脅著我國西瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,但有關(guān)西瓜枯萎病菌致病性機(jī)制的研究相對有限。本文重點研究了西瓜枯萎病菌中細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin-dependent Kinases,CDKs)家族中FoCdk7、 FoCdk9和FoCdk10以及CCR4-NOT(Carbon catabolite repressor 4,negative on TATA-less)復(fù)合體中FoNot2在致病性中的功能及其可能的作用機(jī)制。本文主要依靠基因敲除技術(shù),鑒定到了西瓜枯萎病菌中3個CDKs家族基因FoCdk7、FoCdk9、FoCdk10和1個CCR4-NOT復(fù)合體基因FoNo52;成功獲得其缺失突變體和回補(bǔ)突變體；通過表型分析、致病性測定、脅迫壓力測定和毒素測定等方面研究,系統(tǒng)地分析了這4個基因的生物學(xué)功能。主要研究結(jié)果如下：(1)通過測定菌落形態(tài)、產(chǎn)孢量、分生孢子萌發(fā)率和致病性等表型,發(fā)現(xiàn)FoCdk7、FoCdk9、FoCdk10和FoNot2基因均調(diào)控了西瓜枯萎病菌的氣生菌絲生長、色素合成、產(chǎn)孢量和致病性,并顯著影響了西瓜枯萎病菌的穿透能力,可能是調(diào)控其致病性的首要原因。(2)通過突變體對細(xì)胞壁脅迫因子敏感性研究,發(fā)現(xiàn)FoCdk7、FoCdk9、 FoCdk10和FoNot2基因均可影響西瓜枯萎病菌細(xì)胞壁的完整性,6個幾丁質(zhì)合酶相關(guān)基因的表達(dá)也受到顯著調(diào)控,表明FoCdk7、FoCdk9、FoCdk10和FoNot2基因直接或間接參與調(diào)控西瓜枯萎病菌的細(xì)胞壁完整性途徑。(3)FoCdk7、FoCdk9、FoCdk10和FoNot2基因影響了西瓜枯萎病菌對氧化脅迫的反應(yīng),這些基因的缺失均減弱了對氧化脅迫因子的抗性,5個過氧化物酶合酶相關(guān)基因的表達(dá)也顯著低于野生型,表明FoCdk7、FoCdk9、FoCdk10和FoNot2基因調(diào)控西瓜枯萎病菌的抗氧化脅迫能力。(4)通過HPLC技術(shù)分析菌株中FA毒素含量,發(fā)現(xiàn)△FoCdk7、△FoCdk9、ΔFoCdk10和ΔFoNot2突變體中的FA毒素合成量顯著下降,6個FA合成相關(guān)基因的表達(dá)水平同時也顯著下調(diào),說明了FoCdk7、FoCdk9、FoCdk10和FoNot2基因調(diào)控西瓜枯萎病菌的FA毒素合成,可能是影響其致病性的關(guān)鍵因素。本研究結(jié)果表明,FoCdk7、FoCdk9、FoCdk10和FoNot2基因在西瓜枯萎病菌生長發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)性、致病性和毒素合成等生命過程中均發(fā)揮了重要作用。
【關(guān)鍵詞】：西瓜枯萎病 西瓜枯萎病菌 致病性 CDKs CCR4-NOT FA
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S436.5
【目錄】：

• 致謝5-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述及研究背景14-28
• 1.1 西瓜枯萎病菌致病機(jī)理研究進(jìn)展14-18
• 1.1.1 西瓜枯萎病菌致病性的生理分化14
• 1.1.2 西瓜枯萎病菌的致病機(jī)理14-18
• 1.2細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶及其功能18-21
• 1.2.1 CDKs的發(fā)現(xiàn)、分類及形態(tài)結(jié)構(gòu)18-19
• 1.2.2 真核生物中CDKs的功能19-21
• 1.3 CCR4-NOT復(fù)合體及其功能21-25
• 1.3.1 CCR4-NOT復(fù)合體的組成和結(jié)構(gòu)22-23
• 1.3.2 CCR4-NOT復(fù)合體的功能23-25
• 1.4 本研究的目的意義與主要內(nèi)容25-28
• 1.4.1 研究的目的與意義25-26
• 1.4.2 研究的主要內(nèi)容26-28
• 第二章 材料與方法28-42
• 2.1 實驗材料28-30
• 2.1.1 菌株28
• 2.1.2 載體28
• 2.1.3 供試植物28
• 2.1.4 生化試劑28
• 2.1.5 供試抗生素28
• 2.1.6 供試培養(yǎng)基配方28-29
• 2.1.7 PCR引物(見附表)29-30
• 2.2 實驗方法30-42
• 2.2.1 西瓜枯萎病菌的培養(yǎng)和保存30
• 2.2.2 西瓜枯萎病菌基因組DNA的提取30
• 2.2.3 PCR技術(shù)30-31
• 2.2.4 DNA電泳31
• 2.2.5 DNA克隆與載體構(gòu)建31-32
• 2.2.6 西瓜枯萎病菌的敲除、回補(bǔ)載體構(gòu)建與驗證32
• 2.2.7 西瓜枯萎病菌的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化32-33
• 2.2.8 西瓜枯萎病菌轉(zhuǎn)化子的Southern blot分析33-36
• 2.2.9 西瓜枯萎病菌RNA的提取36
• 2.2.10 cDNA的合成36-37
• 2.2.11 實時熒光定量PCR37
• 2.2.12 西瓜枯萎病菌的生物學(xué)特性分析37
• 2.2.13 西瓜枯萎病菌致病性實驗37-38
• 2.2.14 西瓜枯萎病菌菌量測定38
• 2.2.15 西瓜枯萎病菌的掃描電鏡觀察38
• 2.2.16 西瓜枯萎病菌FA毒素含量測定38-39
• 2.2.17 西瓜枯萎病菌的脅迫壓力測定39
• 2.2.18 西瓜枯萎病菌的幾丁質(zhì)含量檢測39-40
• 2.2.19 西瓜枯萎病菌的過氧化物酶活性測定40-42
• 第三章 結(jié)果與分析42-82
• 3.1 西瓜枯萎病菌FoCdk7、FoCdk9和FoCdk10基因的功能分析42-64
• 3.1.1 FoCdk7、FoCdk9和FoCdk10基因的序列分析42-45
• 3.1.2 FoCdk7、FoCdk9和FoCdk10基因敲除與回補(bǔ)45-48
• 3.1.3 FoCdk7、FoCdk9和FoCdk10基因缺失突變體的菌落形態(tài)48-49
• 3.1.4 FoCdk7、FoCdk9和FoCdk10影響西瓜枯萎病菌產(chǎn)孢與分生孢子萌發(fā)49-51
• 3.1.5 FoCdk7、FoCdk9和FoCdk10基因參與調(diào)控西瓜枯萎病菌的致病51-53
• 3.1.6 FoCdk7、FoCdk9和FoCdk10基因影響西瓜枯萎病菌的侵染能力53-56
• 3.1.7 FoCdk7、FoCdk9和FoCdk10基因影響西瓜枯萎病菌的FA毒素合成56-58
• 3.1.8 FoCdk7、FoCdk9和FoCdk10基因影響西瓜枯萎病菌的細(xì)胞壁完整性58-61
• 3.1.9 FoCdk7、FoCdk9和FoCdk10基因影響西瓜枯萎病菌對氧化脅迫的敏感性61-64
• 3.2 西瓜枯萎病菌FoNot2基因的功能分析64-82
• 3.2.1 FoNot2基因的序列和表達(dá)模式分析64-66
• 3.2.2 FoNot2基因的敲除與回補(bǔ)66-67
• 3.2.3 FoNot2基因缺失突變體的菌落形態(tài)67-68
• 3.2.4 FoNot2基因?qū)ξ鞴峡菸【a(chǎn)孢和形態(tài)分化的影響68-71
• 3.2.5 FoNot2基因調(diào)控了西瓜枯萎病菌的細(xì)胞壁完整性71-73
• 3.2.6 FoNot2基因?qū)ξ鞴峡菸【虏⌒缘挠绊?/span>73-75
• 3.2.7 FoNot2基因影響西瓜枯萎病菌的侵染能力75-77
• 3.2.8 FoNot2基因影響西瓜枯萎病菌的對氧化脅迫的敏感性77
• 3.2.9 FoNot2基因調(diào)控西瓜枯萎病菌FA毒素的合成77-82
• 第四章 全文小結(jié)82-84
• 第五章 討論與展望84-88
• 5.1 討論84-86
• 5.2 后續(xù)工作展望86-88
• 參考文獻(xiàn)88-100
• 附錄100-104

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本文編號：962339