本文關(guān)鍵詞：β-木糖苷酶基因的克隆與重組表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)研究

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【摘要】：木聚糖類半纖維素是一類極為豐富的自然資源,在造紙、紡織及農(nóng)業(yè)廢棄物中廣泛存在,其水解產(chǎn)物可作為碳源生產(chǎn)各種發(fā)酵產(chǎn)物。木聚糖酶可水解木聚糖為低聚木糖,而水解低聚木糖為木糖的p-木糖苷酶是發(fā)酵利用木聚糖類半纖維素的限速酶。p-木糖苷酶的研究主要集中在國外,國內(nèi)研究相對(duì)較少。本文對(duì)一株黑曲霉菌株的p-木糖苷酶基因進(jìn)行克隆、異源表達(dá)與初步的酶學(xué)性質(zhì)研究。本文根據(jù)已報(bào)道的黑曲霉β-木糖苷基因序列為參照,通過同源比對(duì),找出保守序列,設(shè)計(jì)特異性引物,以一株黑曲霉為材料,PCR擴(kuò)增獲得目的基因；克隆得到的β-木糖苷酶基因序列全長(zhǎng)2415 bp,其DNA序列與已知的黑曲霉β-木糖苷酶基因相似度為97%,氨基酸序列相似度為99%；預(yù)測(cè)其78個(gè)堿基序列為信號(hào)肽,預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為4.73。分別以pET32a和pPICZaA構(gòu)建表達(dá)載體,采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行異源表達(dá)。目的基因在pET32a表達(dá)載體中表達(dá)的蛋白為包涵體,在pPICZaA表達(dá)載體中表達(dá)時(shí)發(fā)酵液及菌體中均檢測(cè)到酶活。對(duì)重組pPICZaA載體中表達(dá)的單克隆菌株進(jìn)行篩選,篩選出一株高酶活菌株pPICZaA-xyD11,對(duì)該菌株誘導(dǎo)4天的發(fā)酵液酶活測(cè)定,酶活達(dá)到5.723 U/mL。對(duì)該菌株的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,按接種量OD6000.4-0.5接種于體積分?jǐn)?shù)占總體積的20%的培養(yǎng)瓶中,以1.5%甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)4-5 d后酶活達(dá)到最高,誘導(dǎo)過程中添加EDTA及油酸會(huì)降低酶活,添加體積分?jǐn)?shù)為0.3%的Tween-80可以提高酶活。對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白進(jìn)行了初步的純化。本實(shí)驗(yàn)為該黑曲霉菌株中p-木糖苷酶基因的蛋白表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：黑曲霉 β-木糖苷酶 基因克隆 表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：云南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78;Q55
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-11
• 第一章 緒論11-21
• 1 本課題的研究背景11-19
• 1.1 β-木糖苷酶的簡(jiǎn)介11
• 1.2 β-木糖苷酶的來源11-12
• 1.3 β-木糖苷酶的分類12
• 1.4 β-木糖苷酶的結(jié)構(gòu)12-13
• 1.5 β-木糖苷酶昀催化機(jī)制13
• 1.6 β-木糖苷酶的分離純化13-14
• 1.7 β-木糖苷酶的活性檢測(cè)14
• 1.8 β-木糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)14-15
• 1.9 β-木糖苷酶基因克隆的研究進(jìn)展15-16
• 1.10 β-木糖苷酶基因的克隆方法16-17
• 1.11 β-木糖苷酶的應(yīng)用17-19
• 2. 研究的思路及意義19-21
• 2.1 研究思路19-20
• 2.2 研究意義20-21
• 第二章 目的基因的克隆21-32
• 1 實(shí)驗(yàn)材料21-23
• 1.1 供試菌株與質(zhì)粒21-22
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器22-23
• 1.3 試劑與酶23
• 1.4 試劑配制23
• 2 試驗(yàn)方法23-28
• 2.1 引物設(shè)計(jì)23-24
• 2.2 基因組提取24-26
• 2.3 PCR產(chǎn)物純化26
• 2.4 目的基因的克隆26-27
• 2.5 測(cè)序結(jié)果分析27-28
• 3 結(jié)果與分析28-30
• 3.1 黑曲霉基因組的提取結(jié)果28
• 3.2 目的基因擴(kuò)增結(jié)果28-29
• 3.3 目的基因的克隆及測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果29
• 3.4 測(cè)序結(jié)果及分析29-30
• 4 本章小結(jié)30-32
• 第三章 β-木糖苷酶基因的原核表達(dá)32-40
• 1 實(shí)驗(yàn)材料33
• 2 試驗(yàn)方法33-36
• 2.1 引物設(shè)計(jì)33
• 2.2 克隆質(zhì)粒及表達(dá)質(zhì)粒pET32a的提取33-34
• 2.3 目的基因的PCR擴(kuò)增34
• 2.4 載體及目的基因的雙酶切及膠回收34
• 2.5 酶切片段的連接34-35
• 2.6 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞35
• 2.7 重組質(zhì)粒的驗(yàn)證35-36
• 2.8 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)E.coli BL2I(DE3)感受態(tài)細(xì)胞36
• 2.9 蛋白在E.coli BL21中的表達(dá)36
• 3 結(jié)果與分析36-39
• 3.1 目的基因的PCR結(jié)果36-37
• 3.2 質(zhì)粒及目的基因雙酶切結(jié)果37
• 3.3 重組質(zhì)粒的驗(yàn)證結(jié)果37-38
• 3.4 蛋白在E.coli BL21中的表達(dá)結(jié)果38-39
• 4 本章小結(jié)39-40
• 第四章 β-木糖苷酶基因的真核表達(dá)40-64
• 1 實(shí)驗(yàn)材料41
• 2 實(shí)驗(yàn)方法41-50
• 2.1 引物的設(shè)計(jì)41-42
• 2.2 克隆質(zhì)粒及表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA的提取42
• 2.3 目的基因的PCR擴(kuò)增42
• 2.4 載體及目的基因的雙酶切及膠回收42-43
• 2.5 酶切片段的連接及轉(zhuǎn)化43
• 2.6 重組子的鑒定43
• 2.7 重組子的線性化43-44
• 2.8 酵母感受態(tài)細(xì)胞制備44
• 2.9 重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化44-45
• 2.10 重組畢赤酵母菌株的PCR快速鑒定45
• 2.11 重組酵母菌株的誘導(dǎo)表達(dá)45-46
• 2.12 酶活檢測(cè)46-47
• 2.13 高酶活菌株篩選47
• 2.14 表達(dá)條件優(yōu)化47-50
• 2.15 蛋白純化50
• 3 結(jié)果與分析50-63
• 3.1 目的基因的擴(kuò)增結(jié)果50
• 3.2 目的基因及質(zhì)粒pPICZαA載體的雙酶切結(jié)果50-51
• 3.3 重組子的鑒定結(jié)果51-52
• 3.4 重組質(zhì)粒的線性化結(jié)果52
• 3.5 重組酵母的PCR快速鑒定結(jié)果52-53
• 3.6 酶活檢測(cè)結(jié)果53
• 3.7 高酶活菌株的篩選結(jié)果53-54
• 3.8 表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果54-62
• 3.9 蛋白純化結(jié)果62-63
• 4 本章小結(jié)63-64
• 第五章 結(jié)論與討論64-66
• 1 總結(jié)64
• 2 創(chuàng)新點(diǎn)64-65
• 3 展望65-66
• 附錄66-69
• 參考文獻(xiàn)69-77
• 致謝77

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本文編號(hào)：959554