發(fā)布時間：2017-09-28 05:39

  本文關(guān)鍵詞：玉米彎孢葉斑病菌PG基因家族鑒定及Clpg1在致病性中的作用

  更多相關(guān)文章： 玉米彎孢葉斑病菌 多聚半乳糖醛酸酶 Clpg基因 基因敲除

【摘要】：由新月彎孢[Curvularia lunata(Walker)Boed.]引起的玉米彎孢葉斑病曾在我國北方玉米產(chǎn)區(qū)大發(fā)生,造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失,隨后不斷蔓延至全國,成為玉米生產(chǎn)上的重要病害。本研究采用生物信息學(xué)方法對玉米彎孢葉斑病菌的多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因家族進(jìn)行了鑒定和序列特征分析;研究了該基因家族在果膠誘導(dǎo)下的不同生長時期和在病菌與寄主互作中的表達(dá)模式;采用基因敲除手段,明確了多聚半乳糖醛酸酶家族成員Clpg1基因在玉米彎孢葉斑病菌致病性中的作用,主要研究結(jié)果如下:1.采用生物信息學(xué)方法,從玉米彎孢葉斑病菌中鑒定出4個多聚半乳糖醛酸酶基因家族成員,分別命名為Clpg1、Clpg2、Clpg3和Clpg4,其編碼蛋白的氨基酸最長的序列包含有449個氨基酸殘基,最短的含有273個氨基酸殘基,4個Clpg基因編碼蛋白的分子量大小范圍為27.4~48.5 kD,等電點(diǎn)范圍為5.53~9.19,通過對基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域的分析,發(fā)現(xiàn)4個Clpg基因的外顯子和內(nèi)含子數(shù)量相同,與來源其他真菌中的PG基因具有相同的保守結(jié)構(gòu)域;通過親緣關(guān)系分析,發(fā)現(xiàn)Clpg1、Clpg2、Clpg3和Clpg4被分為兩個大分支,Clpg1、Clpg2和Clpg3處于同一個分支,分別與稻平臍蠕孢菌(Bipolaris oryzae)、番茄匍柄霉(Stemphylium lycopersici)、偃麥草核腔菌(Pyrenophora tritici-repentis)和玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)中的PG基因親緣關(guān)系較近;Clpg3與玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)的PG基因處于同一分支上,親緣關(guān)系較近。2.采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù),分析了玉米彎孢葉斑病菌的4個Clpg基因在果膠誘導(dǎo)的不同時期和病原-寄主植物互作時期的表達(dá)情況,結(jié)果表明Clpg1、Clpg2和Clpg4在第2 d表達(dá)最高,Clpg3在誘導(dǎo)培養(yǎng)第4 d表達(dá)最高;病原與寄主互作3 h時,Clpg1和Clpg3的表達(dá)量達(dá)最高;在接種后24 h時,Clpg2和Clpg4基因表達(dá)量最高,以上結(jié)果表明Clpg基因可能在病菌侵染過程中起一定作用。3.通過Double-joint PCR法構(gòu)建Clpg1的基因敲除載體;通過PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化,獲得抗性轉(zhuǎn)化子79株;通過PCR和RT-PCR技術(shù)從抗性轉(zhuǎn)化子菌株中獲得一個Clpg1基因的敲除突變菌株(△Clpg1)。4.通過對△Clpg1基因敲除突變體的生物學(xué)特性和致病性分析,結(jié)果顯示△Clpg1突變菌株的孢子萌發(fā)率和孢子產(chǎn)量下降;△Clpg1多聚半乳糖醛酸酶的酶活性比野生型菌株DQ-1下調(diào)了16%,通過對離體葉片接種實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)△Clpg1致病性比野生型菌株DQ-1致病性弱,表明玉米彎孢葉斑病菌Clpg1基因影響多聚半乳糖醛酸酶活性,導(dǎo)致致病性降低。
【關(guān)鍵詞】：玉米彎孢葉斑病菌 多聚半乳糖醛酸酶 Clpg基因 基因敲除
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S435.13
【目錄】：

• 摘要4-6
• 英文摘要6-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-20
• 1.1 玉米彎孢葉斑病研究概況12-14
• 1.1.1 玉米彎孢葉斑病菌發(fā)生與危害12-13
• 1.1.2 玉米彎孢葉斑病菌生物學(xué)特性13
• 1.1.3 玉米彎孢葉斑病菌致病機(jī)理13-14
• 1.2 植物病原菌多聚半乳糖醛酸酶研究概況14-17
• 1.3 基因功能研究方法17-19
• 1.3.1 生物信息學(xué)分析方法17-18
• 1.3.2 基因功能驗(yàn)證方法18-19
• 1.4 研究目的與意義19-20
• 第二章 玉米彎孢葉斑病菌多聚半乳糖醛酸酶基因家族成員鑒定20-32
• 2.1 材料與方法20-23
• 2.1.1 供試菌株20
• 2.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基20
• 2.1.3 玉米彎孢葉斑病菌PG基因家族成員鑒定及生物信息學(xué)分析20-21
• 2.1.4 PG基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建21
• 2.1.5 PG基因誘導(dǎo)時期和病菌與寄主植物互作時期表達(dá)分析21-23
• 2.2 結(jié)果與分析23-30
• 2.2.1 PG基因家族成員鑒定23-24
• 2.2.2 Clpg基因家族成員保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測24-25
• 2.2.3 Clpg基因家族成員基因結(jié)構(gòu)分析25
• 2.2.4 Clpg基因家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建25-28
• 2.2.5 Clpg基因家族成員在果膠不同誘導(dǎo)時期表達(dá)量分析28-29
• 2.2.6 Clpg基因家族成員在病原菌與寄主植物互作過程中不同時期表達(dá)量分析29-30
• 2.3 結(jié)論與討論30-32
• 第三章 玉米彎孢葉斑病菌Clpg1基因敲除及突變體鑒定32-44
• 3.1 材料與方法32-39
• 3.1.1 主要試劑與培養(yǎng)基32-33
• 3.1.2 供試菌株及質(zhì)粒33
• 3.1.3 多聚半乳糖醛酸酶Clpg1基因敲除載體構(gòu)建33-37
• 3.1.4 PEG介導(dǎo)玉米彎孢葉斑病菌Clpg1基因敲除與敲除突變體篩選37
• 3.1.5 玉米彎孢葉斑病菌Clpg1基因敲除突變菌株鑒定37-39
• 3.2 結(jié)果與分析39-42
• 3.2.1 Clpg1基因敲除載體構(gòu)建39-40
• 3.2.2 PEG介導(dǎo)的Clpg1基因敲除40-41
• 3.2.3 Clpg1基因敲除突變體菌株篩選及檢測41-42
• 3.3 結(jié)論與討論42-44
• 第四章 Clpg1基因敲除突變體菌株生物學(xué)分析44-52
• 4.1 材料與方法44-46
• 4.1.1 供試菌株及主要培養(yǎng)基44
• 4.1.2 Clpg1基因敲除突變體菌株△Clpg1菌落形態(tài)觀察44
• 4.1.3 Clpg1基因敲除突變體菌株△Clpg1孢子形態(tài)觀察及產(chǎn)孢能力測定44-45
• 4.1.4 Clpg1基因敲除突變體菌株△Clpg1孢子萌發(fā)率測定45
• 4.1.5 Clpg1基因敲除突變體菌株△Clpg1附著胞觀察45
• 4.1.6 Clpg1基因敲除突變體菌株△Clpg1多聚半乳糖醛酸酶酶活性測定45
• 4.1.7 Clpg1基因敲除突變體菌株△Clpg1對離體葉片致病性檢測45-46
• 4.2 結(jié)果與分析46-50
• 4.2.1 Clpg1基因缺失對菌落形態(tài)影響46
• 4.2.2 Clpg1基因缺失對孢子形態(tài)及產(chǎn)孢能力的影響46-47
• 4.2.3 Clpg1基因缺失對孢子萌發(fā)率的影響47-48
• 4.2.4 Clpg1基因缺失對附著胞的影響48
• 4.2.5 Clpg1基因缺失對多聚半乳糖醛酸酶酶活性的影響48-49
• 4.2.6 Clpg1基因缺失對致病性的影響49-50
• 4.3 結(jié)論與討論50-52
• 第五章 結(jié)論52-54
• 參考文獻(xiàn)54-62
• 致謝62-64
• 個人簡歷64-66
• 附錄66

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：934101