本文關(guān)鍵詞：GAB2基因非編碼功能的研究與特征描述

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【摘要】：目的：構(gòu)建含Gab2基因CDS片段,FL片段以及FLM表達(dá)載體并探究Gab2基因是否具有non-coding功能。方法：構(gòu)建CDS,FL和FLM基因表達(dá)載體,然后構(gòu)建瞬轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞系和結(jié)腸癌細(xì)胞系,通過western blot檢測(cè)瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞系中相關(guān)蛋白分子的表達(dá)情況,再通過各種細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)檢測(cè),對(duì)比轉(zhuǎn)入三種質(zhì)粒載體后的細(xì)胞功能差異,以及用Q-PCR檢測(cè)下游基因表達(dá)情況的差異,從而作出Gab2基因CDS區(qū)域以及其真正全長(zhǎng)FL的比較,推測(cè)Gab2基因除了coding功能外是否還具有一定的non-coding功能。結(jié)果：成功構(gòu)建出了Gab2基因的CDS,FL,FLM表達(dá)載體,并構(gòu)建了相應(yīng)的瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞用于功能實(shí)驗(yàn)和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè),在功能實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)指標(biāo)以及Real-time PCR的檢測(cè)結(jié)果中都顯示著Gab2基因的CDS片段功能與其全長(zhǎng)FL有一定的相似性,但也存在著很大的差異,甚至有很多相反的情況出現(xiàn)。結(jié)論：Gab2基因的功能可能并不僅僅取決于其CDS區(qū)域,其非編碼區(qū)可能也發(fā)揮著很重要的功能,致使整個(gè)基因的功能與由其編碼區(qū)域單獨(dú)的功能有很多的差異,因此即使是對(duì)于所熟識(shí)的coding基因,也應(yīng)當(dāng)從整體來看待一個(gè)基因的功能,而不是只著重于轉(zhuǎn)錄翻譯的CDS區(qū)。
【關(guān)鍵詞】：編碼基因 非編碼基因 GAB2基因 編碼區(qū)域 基因
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78
【目錄】：

• 致謝5-9
• 中文內(nèi)容摘要9-10
• ABSTRACT10-11
• 第一章 背景11-17
• 1.1 Gab2基因和Gab2蛋白概述11-13
• 1.1.1 Gab2基因及其表達(dá)蛋白綜述11
• 1.1.2 Gab2介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制11-12
• 1.1.3 Gab2與乳腺癌的關(guān)系12-13
• 1.1.4 Gab2與結(jié)腸癌的關(guān)系13
• 1.2 基因組成概述13-15
• 1.2.1 3'UTR片段的位置13
• 1.2.2 3'UTR片段與microRNA的關(guān)系13-14
• 1.2.3 Coding Sequence(CDS)區(qū)域概述14-15
• 1.2.4 Mutation對(duì)基因表達(dá)的影響15
• 1.3 non-coding基因及non-coding功能簡(jiǎn)介15-16
• 1.4 MCF-7細(xì)胞概述16
• 1.5 HCT116細(xì)胞概述16-17
• 第二章 實(shí)驗(yàn)過與方法17-39
• 2.1 構(gòu)建Gab2基因片段表達(dá)載體17-22
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料17
• 2.1.2 CDS和full-length(FL)片段的擴(kuò)增17-19
• 2.1.3 mutation(FLM)的構(gòu)建19
• 2.1.4 制備感受態(tài)細(xì)菌19-20
• 2.1.5 CDS,FL以及FLM片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建20-22
• 2.2 構(gòu)建空質(zhì)粒載體(VEC),CDS,FL和FLM瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞系22-26
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料22-23
• 2.2.2 重組質(zhì)粒的中量抽取23-24
• 2.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染24-26
• 2.3 瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞系中基因表達(dá)情況的檢測(cè)26-30
• 2.3.1 實(shí)驗(yàn)材料26
• 2.3.2 Total RNA的抽取26-27
• 2.3.3 miRNA的抽取27
• 2.3.4 逆轉(zhuǎn)錄27-28
• 2.3.5 實(shí)時(shí)定量熒光PCR(Real-time PCR)28
• 2.3.6 Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)情況28-30
• 2.4 內(nèi)源性GAB2基因敲除細(xì)胞系的建立30-31
• 2.4.1 實(shí)驗(yàn)材料30
• 2.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染siRNA30-31
• 2.4.3 敲除效果測(cè)定31
• 2.5 體外瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞功能檢測(cè)31-35
• 2.5.1 Soft Agar檢測(cè)細(xì)胞活性31-32
• 2.5.2 MTT Assay檢測(cè)細(xì)胞存活能力32-33
• 2.5.3 Transwell Assay檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力33-35
• 2.6 回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞功能的區(qū)別35-37
• 2.6.1 實(shí)驗(yàn)材料35
• 2.6.2 共轉(zhuǎn)質(zhì)粒和siRNA35-36
• 2.6.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)回補(bǔ)效果36
• 2.6.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)回補(bǔ)效果36-37
• 2.7 RNA-seq檢測(cè)瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞系中mRNA的表達(dá)變化37-38
• 2.7.1 實(shí)驗(yàn)材料37
• 2.7.2 實(shí)驗(yàn)原理37
• 2.7.3 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>37
• 2.7.4 實(shí)驗(yàn)方法37
• 2.7.5 細(xì)胞系中的驗(yàn)證37-38
• 2.8 臨床樣品的檢測(cè)38-39
• 2.8.1 臨床樣品的收集38
• 2.8.2 臨床樣品提取total RNA38
• 2.8.3 total RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA38
• 2.8.4 實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)38-39
• 第三章 細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論39-53
• 3.1 克隆相關(guān)的結(jié)果39-41
• 3.1.1 pcDNA3.1示意圖39-40
• 3.1.2 克隆載體構(gòu)建結(jié)果40-41
• 3.2 實(shí)時(shí)定量熒光PCR結(jié)果41-42
• 3.2.1 各細(xì)胞系GAB2基因表達(dá)情況檢測(cè)41
• 3.2.2 順轉(zhuǎn)細(xì)胞系GAB2基因表達(dá)情況檢測(cè)41-42
• 3.3 Western Blot測(cè)量細(xì)胞中Gab2蛋白表達(dá)量的結(jié)果42-43
• 3.4 Soft Agar實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-46
• 3.5 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-47
• 3.6 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-49
• 3.7 GAB2基因敲除結(jié)果49-51
• 3.7.1 Real-time PCR檢測(cè)敲除效率49-50
• 3.7.2 基因敲除后細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-51
• 3.8 回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果51
• 3.9 細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)總結(jié)51-53
• 第四章 RNA-seq結(jié)果與驗(yàn)證53-59
• 4.1 RNA-seq檢測(cè)結(jié)果53-54
• 4.2 RNA-seq變化基因統(tǒng)計(jì)54-55
• 4.3 調(diào)控基因在細(xì)胞系中的驗(yàn)證55-56
• 4.4 臨床樣品驗(yàn)證結(jié)果56-59
• 第五章 總結(jié)與討論59-63
• 5.1 過往的認(rèn)知59-60
• 5.2 對(duì)權(quán)威的疑惑60
• 5.3 編碼基因和非編碼基因的真正區(qū)別60-62
• 5.4 對(duì)未來工作的展望62-63
• 附錄63-69
• 參考文獻(xiàn)69-72

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