本文關(guān)鍵詞：中國(guó)大鯢FoxA2、FoxC2和FoxL2基因cDNA序列的克隆及組織表達(dá)分析

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【摘要】：Fox(winged helix/forkhead)基因家族廣泛存在于真核生物中,其FH結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化中高度保守,根據(jù)相似性將其成員劃分為FoxA-FoxS19個(gè)亞族。FH結(jié)構(gòu)保守卻功能多樣,翻譯后修飾可以使得Fox轉(zhuǎn)錄因子家族形成目標(biāo)子集來特異性應(yīng)答環(huán)境中的信號(hào)。Fox家族多個(gè)成員與人類疾病緊密相關(guān),成為目前研究的熱點(diǎn)。FoxA2基因是調(diào)節(jié)肝臟、胰腺等器官的發(fā)育及機(jī)體多條代謝途徑的關(guān)鍵基因之一,被認(rèn)為是遺傳控制的一個(gè)開關(guān)。FoxC2基因是一類調(diào)控血管和淋巴管等脈管系統(tǒng)生長(zhǎng)、發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子。近年來也發(fā)現(xiàn)其與多種癌癥相關(guān),參與腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移,是遺傳疾病淋巴水腫-重睫綜合癥(lymphedema-distichiasis syndrome,LD)的致病基因。FoxL2基因是早期卵巢標(biāo)志物之一,FoxL2作為雌性個(gè)體性別表型相關(guān)的體細(xì)胞標(biāo)記基因,通過參與調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞增殖與分化,在卵泡的正常發(fā)育及卵巢功能的維持中發(fā)揮作用,是小瞼裂綜合癥(blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome,BPES)的致病基因。本研究采用普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)及cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)克隆獲得中國(guó)大鯢FoxC2和FoxL2基因的全長(zhǎng)序列,以及FoxA2基因的cDNA全長(zhǎng)序列,并對(duì)其進(jìn)行序列分析,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)中國(guó)大鯢各組織中它們的表達(dá)情況進(jìn)行分析。得到如下結(jié)果：1.FoxA2基因的cDNA序列全長(zhǎng)為1574bp,編碼429個(gè)氨基酸,NCBI接收號(hào)為KU974963,FH區(qū)包含91個(gè)氨基酸,該基因相似性分析顯示其核苷酸和氨基酸序列與兩棲類具有很高的相似性,與哺乳類相似性較低。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示中國(guó)大鯢與兩棲類非洲爪蟾、熱帶爪蟾聚為單群,分布在外圍,與魚類單群相鄰,體現(xiàn)出其水陸過渡的獨(dú)特進(jìn)化地位。2.FoxC2基因的cDNA序列全長(zhǎng)為1841bp,共編碼474個(gè)氨基酸,NCBI接收號(hào)為KU315724,FH區(qū)包含91個(gè)氨基酸,該基因相似性分析顯示其核苷酸和氨基酸序列與兩棲類相似性較高,與魚類和哺乳類相似性較低。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示魚類斑點(diǎn)雀鱔分布于兩棲類大群中,大鯢分布在該群的外圍,體現(xiàn)出大鯢與魚類FoxC2蛋白進(jìn)化關(guān)系更加密切。3.FoxL2基因的cDNA序列全長(zhǎng)為1296bp,共編碼300個(gè)氨基酸,NCBI接收號(hào)為KU310892,FH區(qū)包含91個(gè)氨基酸,是其主要的DNA序列結(jié)合區(qū),該基因相似性分析顯示其核苷酸和氨基酸序列與兩棲類具有很高的相似性,C末端作為轉(zhuǎn)錄激活區(qū),也具有較高的保守性。翻譯后修飾分析顯示FoxL2含有較多磷酸化位點(diǎn),推測(cè)其在體內(nèi)的活性可能是通過磷酸化調(diào)控的。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示中國(guó)大鯢從兩棲類與硬骨魚類的大群中單獨(dú)分出,體現(xiàn)出其古老的進(jìn)化地位。4.利用熒光定量PCR方法分析中國(guó)大鯢FoxA2、FoxC2和FoxL2基因的組織表達(dá)情況,結(jié)果顯示：FoxA2基因在肺中表達(dá)量最高,肝臟、腸道和卵巢中表達(dá)較低,精巢、脾臟、肌肉和腎臟中不表達(dá)。FoxC2基因在心臟和腎臟中表達(dá)量最高,精巢和肌肉中次之,肺和卵巢中較低,肝臟、脾臟和腸道中不表達(dá)。FoxL2基因在卵巢表達(dá)量最高,腎臟表達(dá)量次之,肌肉、精巢和肺中的表達(dá)量較低,肝臟、脾臟和腸道不表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：中國(guó)大鯢 FoxA2 FoxC2 FoxL2 基因克隆 組織表達(dá)分析
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4;Q78
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 文獻(xiàn)綜述10-20
• 1.1 Fox轉(zhuǎn)錄因子家族10-13
• 1.1.1 Fox家族的由來與命名10
• 1.1.2 Fox家族的調(diào)節(jié)機(jī)制10-12
• 1.1.3 Fox基因家族的功能12-13
• 1.2 FoxA2、FoxC2和FoxL2的研究進(jìn)展13-18
• 1.2.1 FoxA2概述13-15
• 1.2.2 FoxC2概述15-16
• 1.2.3 FoxL2概述16-18
• 1.3 本研究的目的及意義18-20
• 2 材料和方法20-33
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物20
• 2.2 試劑及主要試劑的配制20-21
• 2.2.1 本研究所用的試劑及菌種20-21
• 2.2.2 主要試劑的配制21
• 2.3 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備21-22
• 2.4 模板制備22-25
• 2.4.1 各組織總RNA的提取22
• 2.4.2 cDNA第一鏈的合成22-23
• 2.4.3 RACE模板的制備23-25
• 2.5 引物設(shè)計(jì)25-26
• 2.6 FoxC2、FoxL2基因全長(zhǎng)序列及FoxA2基因中間片段獲得26-28
• 2.6.1 PCR擴(kuò)增26-27
• 2.6.2 PCR產(chǎn)物的回收27
• 2.6.3 連接27-28
• 2.6.4 轉(zhuǎn)化28
• 2.6.5 菌落PCR鑒定28
• 2.7 FoxA2 cDNA末端序列快速擴(kuò)增28-29
• 2.7.1 3'-RACE擴(kuò)增28-29
• 2.7.2 5'-RACE擴(kuò)增29
• 2.8 序列分析29-30
• 2.9 熒光定量PCR檢測(cè)中國(guó)大鯢FoxA2、FoxC2和FoxL2基因在各組織中的表達(dá)30-33
• 2.9.1 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)30-31
• 2.9.2 最適退火溫度的選擇31
• 2.9.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作31-32
• 2.9.4 各組織中FoxA2、FoxC2和FoxL2基因的表達(dá)檢測(cè)32
• 2.9.5 數(shù)據(jù)分析32-33
• 3 結(jié)果與分析33-53
• 3.1 DNA與RNA提取結(jié)果33
• 3.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果33-35
• 3.2.1 FoxC2、FoxL2基因全長(zhǎng)及FoxA2中間片段33-34
• 3.2.2 FoxA2 RACE擴(kuò)增34-35
• 3.3 FoxA2、FoxC2和FoxL2基因核苷酸序列分析35-38
• 3.4 FoxA2、FoxC2和FoxL2基因蛋白質(zhì)序列分析38-49
• 3.4.1 FoxA2、FoxC2和FoxL2基因蛋白質(zhì)序列基本性質(zhì)38-40
• 3.4.2 FoxA2、FoxC2和FoxL2基因序列相似性分析40-42
• 3.4.3 FoxA2、FoxC2和FoxL2基因蛋白質(zhì)序列比對(duì)42-46
• 3.4.4 FoxA2、FoxC2和FoxL2基因蛋白質(zhì)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建46-48
• 3.4.5 Fox基因家族進(jìn)化48-49
• 3.5 FoxA2、FoxC2和FoxL2基因在大鯢各組織的表達(dá)49-53
• 3.5.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線49-50
• 3.5.2 中國(guó)大鯢FoxA2、FoxC2和FoxL2基因各組織的差異表達(dá)50-53
• 4 討論53-57
• 4.1 FoxA2基因的序列分析53
• 4.2 FoxC2基因的序列分析53-54
• 4.3 FoxL2基因的序列分析54-55
• 4.4 Fox基因家族進(jìn)化分析55
• 4.5 FoxA2、FoxC2和FoxL2基因的組織表達(dá)分析55-57
• 5 結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-63
• 致謝63-64
• 在學(xué)期間發(fā)表文章64

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