本文關(guān)鍵詞：渾濁紅球菌脂質(zhì)積累機(jī)制的碳代謝流分析及關(guān)鍵基因改造

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【摘要】：產(chǎn)油微生物能夠在細(xì)胞內(nèi)積累大量甘油三酯,是傳統(tǒng)動(dòng)植物油脂的重要替代資源。同時(shí),來自微生物發(fā)酵生產(chǎn)的脂肪酸還是交通燃料和合成化工產(chǎn)品的重要前體,因此十分有必要研究和開發(fā)一些能夠高產(chǎn)脂的微生物菌株。產(chǎn)油細(xì)菌渾濁紅球菌PD630(Rhodococcus opacus PD630)具有產(chǎn)脂量高、高細(xì)胞密度培養(yǎng)、利用多種碳源、基因組信息已經(jīng)公布、而且建立了一套完善的遺傳改造體系等特點(diǎn),是工業(yè)化生產(chǎn)微生物油脂最具潛力的菌株之一。然而,渾濁紅球菌PD630脂質(zhì)積累機(jī)制還沒有系統(tǒng)地分析和研究,本文通過基于GC-MS的13C代謝流分析(13C Metabolic flux analysis,13C-MFA)方法系統(tǒng)研究了高氮(HN)和低氮(LN)兩種不同產(chǎn)脂培養(yǎng)條件下渾濁紅球菌PD630脂質(zhì)代謝調(diào)控上的差異;結(jié)合轉(zhuǎn)錄和酶活性分析找出了影響渾濁紅球菌PD630脂質(zhì)積累的關(guān)鍵調(diào)控基因;通過基因工程過表達(dá)這些關(guān)鍵基因,有效提高其脂質(zhì)含量。本論文的主要研究內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:首先,通過對(duì)渾濁紅球菌PD630在HN(C/N,10:1)和LN(C/N,100:1)兩種培養(yǎng)條件下生長和脂質(zhì)差異的分析,發(fā)現(xiàn)氮源濃度對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)含量有較大的影響。渾濁紅球菌PD630在培養(yǎng)44 h后達(dá)到代謝穩(wěn)定期。此時(shí)比生長速率最大,LN培養(yǎng)條件下的脂肪酸含量高達(dá)34.68%,HN培養(yǎng)條件下的脂肪酸含量卻只有18.99%,而蛋白質(zhì)的含量卻從30.52%降到17.39%。然后,采用13C標(biāo)記的代謝流分析方法對(duì)渾濁紅球菌PD630在兩種培養(yǎng)條件下脂質(zhì)合成過程代謝反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中代謝流量的分布進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,兩種培養(yǎng)條件下渾濁紅球菌PD630細(xì)胞內(nèi)不同的代謝流量分配比造成了其脂質(zhì)積累的差別。兩種培養(yǎng)條件下經(jīng)過磷酸戊糖(PP)路徑和Entner-Doudoroff(ED)路徑這兩條代謝途徑總的代謝流量分布均超過90%,該結(jié)果表明在產(chǎn)油細(xì)菌渾濁紅球菌PD630中PP和ED路徑是其糖代謝的主要途徑。然而,與HN培養(yǎng)條件相比,LN條件培養(yǎng)渾濁紅球菌PD630時(shí),流經(jīng)PP路徑的碳流量是HN培養(yǎng)條件下的5倍,而流經(jīng)ED路徑的碳流量只有HN培養(yǎng)條件下一半。這些結(jié)果與LN培養(yǎng)條件下6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGDH)轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)及酶活性的增加相對(duì)應(yīng)。然而在LN培養(yǎng)條件下經(jīng)蘋果酸酶(ME)催化蘋果酸(Mal)向丙酮酸(Pyr)(Mal+NADP+?Pyr+CO2+NADPH)轉(zhuǎn)化的量是HN培養(yǎng)條件下的一半。這些結(jié)果表明,在渾濁紅球菌PD630中PP路徑中的6PGDH是提供脂質(zhì)生物合成所需還原力NADPH的關(guān)鍵酶,而不是ME。最后,將來自PP路徑中編碼6PGDH的五個(gè)同源基因gnd分別在產(chǎn)油細(xì)菌渾濁紅球菌PD630中過表達(dá)。在渾濁紅球菌PD630過表達(dá)菌株中,6PGDH的酶活力及相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高。與對(duì)照菌株相比較,過表達(dá)重組菌株的總脂肪酸含量提高了20~28%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,來自PP路徑的6PGDH在渾濁紅球菌PD630脂肪酸合成過程中起到重要的調(diào)控作用,是其脂肪酸合成所需還原力NADPH的主要提供者。
【關(guān)鍵詞】：渾濁紅球菌PD630 代謝流分析 磷酸戊糖路徑 6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶 NADPH
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q93;TQ641
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 縮寫符號(hào)對(duì)照表6-9
• 1 緒論9-18
• 1.1 產(chǎn)油微生物的研究進(jìn)展9-11
• 1.1.1 概述9
• 1.1.2 微生物油脂在生物柴油中的應(yīng)用進(jìn)展9-10
• 1.1.3 微生物油脂在食品中的應(yīng)用進(jìn)展10-11
• 1.2 產(chǎn)油微生物及其脂質(zhì)積累機(jī)制11-13
• 1.2.1 產(chǎn)油微生物脂肪酸合成代謝調(diào)控11
• 1.2.2 脂肪酸合成還原力NADPH的來源11-12
• 1.2.3 脂肪酸合成底物的供應(yīng)12-13
• 1.3 渾濁紅球菌PD630簡介及其脂質(zhì)積累研究現(xiàn)狀13-15
• 1.3.1 渾濁紅球菌簡介13
• 1.3.2 渾濁紅球菌PD630研究概況13-15
• 1.4 代謝流量分析15-16
• 1.4.1 計(jì)量學(xué)代謝流量分析方法15-16
• 1.4.2 基于同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的代謝流量分析方法16
• 1.5 課題立題意義及主要研究內(nèi)容16-18
• 2 材料與方法18-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料18-21
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)主要儀器與設(shè)備18
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑18
• 2.1.3 培養(yǎng)基及其配方18-19
• 2.1.4 主要試劑的配制19
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒19-20
• 2.1.6 引物的合成和測序20-21
• 2.2 ~（13）C標(biāo)記的代謝流分析方法21-28
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)21
• 2.2.2 發(fā)酵上清液組分分析21-22
• 2.2.3 R. opacus PD630生物質(zhì)的測定22-23
• 2.2.4 蛋白質(zhì)水解、衍生及GC-MS分析23
• 2.2.5 R. opacus PD630代謝網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建23-25
• 2.2.6 R. opacus PD630代謝流量配比的計(jì)算分析25-28
• 2.3 分子克隆的實(shí)驗(yàn)方法28-33
• 2.3.1 引物設(shè)計(jì)和目的基因片段的擴(kuò)增28-29
• 2.3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建29-31
• 2.3.3 過表達(dá)菌株的構(gòu)建31
• 2.3.4 R. opacus PD630重組菌株的培養(yǎng)31
• 2.3.5 轉(zhuǎn)錄水平的檢測31-33
• 2.3.6 6PGDH酶活性水平的檢測33
• 2.4 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析33-34
• 3 結(jié)果與討論34-48
• 3.1 ~（13）C標(biāo)記的代謝流分析34-40
• 3.1.1 HN和LN培養(yǎng)條件下R. opacus PD630的生長和細(xì)胞組成34-38
• 3.1.2 R. opacus PD630細(xì)胞內(nèi)~（13）C標(biāo)記的代謝流分析結(jié)果38-40
• 3.2 6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶對(duì)R. opacus PD630脂質(zhì)積累的影響40-48
• 3.2.1 6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶基因的克隆40-41
• 3.2.2 gnd過表達(dá)重組載體的構(gòu)建41-42
• 3.2.3 R. opacus PD630過表達(dá)重組菌株的構(gòu)建42
• 3.2.4 R. opacus PD630過表達(dá)重組菌株生長和脂質(zhì)積累的分析42-45
• 3.2.5 R. opacus PD630過表達(dá)重組菌株 6PGDH酶活性分析45-46
• 3.2.6 R. opacus PD630過表達(dá)重組菌株相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的分析46-48
• 主要結(jié)論與展望48-50
• 致謝50-51
• 參考文獻(xiàn)51-58
• 附錄I：R. opacus PD630的代謝化學(xué)計(jì)量平衡式58-61
• 附錄II：作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文61

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本文編號(hào)：918771