本文關(guān)鍵詞：刺槐中三個(gè)新分離基因在共生固氮過(guò)程中的功能研究

  更多相關(guān)文章： 刺槐 共生相關(guān)基因 亞細(xì)胞定位 RNA干擾 過(guò)量表達(dá)

【摘要】：本研究以刺槐(Robinia pseudoacacia)---中慢生根瘤菌(Mesorhizobium amorphae CCNWGS0123)共生固氮體系為模式,以之前實(shí)驗(yàn)室采用抑制差減雜交技術(shù)建立的刺槐根部c DNA文庫(kù)中篩選得到的三個(gè)宿主植物基因(fan37、fan84、f107)作為研究對(duì)象,利用q RT-PCR技術(shù)對(duì)這三個(gè)基因在刺槐根部及結(jié)瘤過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)特征進(jìn)行了分析;通過(guò)RACE方法獲得其中兩個(gè)基因(fan84、f107)的全長(zhǎng)c DNA序列,構(gòu)建了三個(gè)基因的RNAi載體及其中兩個(gè)基因(fan84、f107)的過(guò)量表達(dá)與亞細(xì)胞定位載體;結(jié)合刺槐毛狀根轉(zhuǎn)化體系,并借助發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)用構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化宿主植物根部并進(jìn)行以下分析研究:接菌第10天進(jìn)行熒光顯微鏡下侵染事件的觀察與統(tǒng)計(jì)、利用q RT-PCR分析目的基因在接菌15天和接菌30天兩個(gè)不同時(shí)期的RNAi效率和過(guò)量表達(dá)效率、分別對(duì)RNAi轉(zhuǎn)化苗在接菌第30天和過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)化苗在接菌第45天的株高、根長(zhǎng)、鮮重以及有效結(jié)瘤數(shù)進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)、分別取接菌第30天的RNAi根瘤及接菌第45天的過(guò)量表達(dá)根瘤進(jìn)行石蠟切片觀察。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn),從表型及分子水平初步揭示這三個(gè)基因在刺槐共生根瘤形成過(guò)程中的的功能。1、fan84和f107 cDNA全長(zhǎng)的獲得采用c DNA末端快速擴(kuò)增法(RACE)技術(shù),以刺槐接種根瘤菌后第15天和第20天根中的總RNA為模板,分別構(gòu)建5’和3’RACE c DNA文庫(kù);根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)獲得的基因片段信息分別設(shè)計(jì)目的基因特異性引物GSP1,GSP2,擴(kuò)增并獲得這兩個(gè)基因的5’和3’序列,通過(guò)重疊區(qū)的比對(duì)拼接獲得基因全長(zhǎng)c DNA序列;2、fan84和f107亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建及蛋白的定位分析利用獲得的全長(zhǎng)c DNA序列的ORF區(qū)設(shè)計(jì)相應(yīng)的亞細(xì)胞定位引物,構(gòu)建目的基因亞細(xì)胞定位載體,通過(guò)洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化宿主根部,分別研究了靶蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞和刺槐毛狀根細(xì)胞中的分布。結(jié)果顯示,fan84與GFP融合蛋白在細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中都有分布;f107與GFP融合蛋白則主要在細(xì)胞核、細(xì)胞膜中表達(dá)。3、目的基因干擾載體、過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建及其結(jié)瘤表型分析構(gòu)建基因fan37、fan84、f107 RNA干擾載體和基因fan84、f107過(guò)量表達(dá)載體,通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化刺槐根部,觀察目的基因沉默或過(guò)表達(dá)后對(duì)刺槐植株發(fā)育,根瘤菌侵染過(guò)程以及根瘤形成的影響。結(jié)果表明,在接種后15d和30d的RNAi根中目的基因的表達(dá)被有效沉默,過(guò)表達(dá)根中目的基因的表達(dá)量均顯著升高。目的基因被干擾后,接菌后10天進(jìn)行侵染事件的統(tǒng)計(jì),結(jié)果顯示,fan84干擾植株根毛卷曲、根毛侵染線、皮層侵染線、根瘤原基數(shù)目均明顯下降,fan37干擾植株中除了皮層侵染線數(shù)目與對(duì)照無(wú)顯著區(qū)別外,其余各項(xiàng)指標(biāo)也都降低;與對(duì)照相比,f107干擾后不影響根毛卷曲數(shù)目,但是侵染線和根瘤原基形成明顯減少。與接菌后30d的對(duì)照相比,fan37和fan84 RNAi刺槐苗表現(xiàn)為植株矮小、根毛粗短稀疏,其株高、根長(zhǎng)、鮮重、結(jié)瘤數(shù)目明顯減少;f107干擾苗表現(xiàn)為植株矮小,株高、鮮重降低,但根長(zhǎng)和結(jié)瘤數(shù)目沒(méi)有明顯改變。接種后30天根瘤的石蠟切片觀察結(jié)果表明:fan37、fan84干擾后的植株根瘤中的侵染細(xì)胞在數(shù)目及密集程度上不及對(duì)照根瘤,特別是fan84;f107干擾后的植株根瘤中侵染區(qū)明顯增大,其中可見較多的侵染線,表明根瘤菌的釋放受到抑制。豆血紅蛋白基因q PCR分析顯示,三個(gè)目的基因的沉默使得根瘤的功能受損。過(guò)量表達(dá)結(jié)果在表型上:fan84過(guò)表達(dá)刺槐表現(xiàn)為根長(zhǎng)變長(zhǎng),鮮重增加,株高和結(jié)瘤數(shù)與對(duì)照無(wú)差異;f107刺槐表現(xiàn)為鮮重降低,結(jié)瘤數(shù)目減少,而株高和根長(zhǎng)均無(wú)顯著差異。fan84和f107過(guò)量表達(dá)植株的根瘤石蠟切片與對(duì)照相比,在接菌45d,根瘤內(nèi)部含菌細(xì)胞數(shù)量依然很多,細(xì)胞形態(tài)也沒(méi)有發(fā)生皺縮等衰老跡象。
【關(guān)鍵詞】：刺槐 共生相關(guān)基因 亞細(xì)胞定位 RNA干擾 過(guò)量表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S792.27;Q945.13
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-19
• 1.1 固氮作用11
• 1.2 豆科植物和生物固氮11-17
• 1.2.1 豆科植物與根瘤菌11
• 1.2.2 根瘤器官的形成11-13
• 1.2.3 根瘤的類型：定型瘤和不定型瘤13-14
• 1.2.4 豆科植物結(jié)瘤分子機(jī)制14-17
• 1.3 植物基因功能研究技術(shù)17-18
• 1.4 技術(shù)路線18-19
• 第二章 目的基因的時(shí)空表達(dá)分析與cDNA末端的快速擴(kuò)增(RACE)19-30
• 2.1 引言19
• 2.2 目的基因的時(shí)空表達(dá)分析19-21
• 2.3 材料、試劑和儀器21-22
• 2.3.1 實(shí)驗(yàn)材料及載體21
• 2.3.2 實(shí)驗(yàn)試劑21
• 2.3.3 實(shí)驗(yàn)儀器21-22
• 2.4 實(shí)驗(yàn)方法22-26
• 2.4.1 刺槐根總RNA的提取及基因組DNA的去除22-23
• 2.4.2 候選基因的cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)23-25
• 2.4.3 目的片段膠回收25
• 2.4.4 目的片段連接T載體并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌25
• 2.4.5 菌落PCR檢測(cè)目的片段的連接情況25-26
• 2.4.6 質(zhì)粒的提取26
• 2.4.7 全長(zhǎng)的獲得及序列分析26
• 2.5 結(jié)果與分析26-29
• 2.5.1 總RNA提取及基因組DNA的去除結(jié)果26-27
• 2.5.2 RACE反應(yīng)結(jié)果27-29
• 2.6 討論29-30
• 第三章 目的基因的亞細(xì)胞定位30-38
• 3.1 引言30
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料、儀器30
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料30
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器30
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法30-33
• 3.3.1 亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建30-32
• 3.3.2 基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞32-33
• 3.4 結(jié)果與分析33-37
• 3.4.1 亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建33-35
• 3.4.2 亞細(xì)胞定位結(jié)果與分析35-37
• 3.5 討論37-38
• 第四章 目的基因的RNA沉默與過(guò)表達(dá)38-67
• 4.1 引言38
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器38
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料38
• 4.2.2 試劑與配方38
• 4.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器38
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法38-45
• 4.3.1RNAi載體的構(gòu)建38-41
• 4.3.2 過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建41
• 4.3.3 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌K59941-42
• 4.3.4 刺槐的轉(zhuǎn)化體系42-43
• 4.3.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果鑒定43-45
• 4.4 結(jié)果與分析45-65
• 4.4.1 目的基因的擴(kuò)增結(jié)果45-46
• 4.4.2 RNA沉默載體的構(gòu)建46-47
• 4.4.3 過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建47-48
• 4.4.4 轉(zhuǎn)化苗植株表型檢測(cè)48-52
• 4.4.5 刺槐根部提取的總RNA質(zhì)量檢測(cè)52-53
• 4.4.6 干擾及過(guò)表達(dá)效率檢測(cè)53-56
• 4.4.7 轉(zhuǎn)化苗植株表型及根瘤的形態(tài)56-63
• 4.4.8 根瘤顯微形態(tài)觀測(cè)63-65
• 4.5 討論65-67
• 第五章 結(jié)論67-68
• 參考文獻(xiàn)68-75
• 附錄75-79
• 致謝79-80
• 作者簡(jiǎn)介80

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