本文關(guān)鍵詞：Mark4基因通過調(diào)控脂肪細胞自噬影響白脂棕色化的分子機制研究

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【摘要】：MAP微管親和調(diào)節(jié)激酶4(Mark4)屬于絲氨酸-蘇氨酸激酶家族成員,調(diào)控作用十分廣泛。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)Mark4敲缺鼠表現(xiàn)出食欲增強、活動量增多、代謝率提高,上調(diào)棕色脂肪組織(BAT)活性,而超表達Mark4可促進脂滴沉積。自噬是通過溶酶體系統(tǒng)降解胞內(nèi)錯誤折疊蛋白和受損細胞器,維持細胞穩(wěn)態(tài)的進化保守過程。抑制脂肪特異性自噬可增加棕色樣脂肪細胞數(shù)量,有利于脂肪酸氧化和提高胰島素敏感性。白色脂肪組織棕色化簡稱白脂棕色化,即是誘導(dǎo)白脂中出現(xiàn)棕色樣米色脂肪細胞,增加機體能量消耗。抑制自噬可增加米色脂肪細胞數(shù)量,干擾掉Mark4同樣可以上調(diào)BAT活性,由此推測Mark4-自噬-白脂棕色化有一定聯(lián)系,而Mark4能否影響自噬與白脂棕色化未見報道。本研究為了明確Mark4調(diào)控脂肪細胞自噬與白脂棕色化機制,在3T3-L1脂肪細胞超表達和干擾Mark4基因,得到以下結(jié)果:1.Mark4調(diào)控血清饑餓誘導(dǎo)的脂肪細胞自噬:血清饑餓8h成功構(gòu)建脂肪細胞自噬模型。在饑餓模型基礎(chǔ)上分析Mark4對自噬的影響,結(jié)果表明超表達Mark4顯著提高促自噬因子Beclin1、ATG7的表達(P0.05),促進自噬標(biāo)志蛋白LC3A轉(zhuǎn)化為LC3B(P0.05),抑制P62蛋白表達(P0.05),同時發(fā)現(xiàn)自噬泡數(shù)量顯著增多(P0.05),細胞內(nèi)綠色熒光蛋白GFP-LC3表達增多(P0.05),干擾Mark4組呈現(xiàn)相反趨勢,說明Mark4促進饑餓誘導(dǎo)的脂肪細胞自噬。進一步研究發(fā)現(xiàn)超表達Mark4顯著提高AMPK磷酸化水平,顯著降低AKT磷酸化水平,伴隨著LC3A向LC3B轉(zhuǎn)化增多,P62蛋白水平降低(P0.05),干擾組則呈現(xiàn)相反的趨勢,說明Mark4通過激活A(yù)MPK信號通路、抑制AKT信號通路促進血清饑餓誘導(dǎo)的自噬發(fā)生。2.Mark4調(diào)控雷帕霉素(Rapa)誘導(dǎo)的脂肪細胞自噬:100nM Rapa處理12h成功構(gòu)建脂肪細胞自噬模型。在Rapa誘導(dǎo)自噬模型基礎(chǔ)上分析Mark4對自噬的影響,結(jié)果表明超表達Mark4顯著提高促自噬因子Beclin1、ATG7的表達(P0.05),促進自噬標(biāo)志蛋白LC3A向LC3B轉(zhuǎn)化,抑制P62蛋白表達(P0.05),酸性自噬泡數(shù)量顯著增多(P0.05),細胞內(nèi)綠色熒光蛋白GFP-LC3表達增多(P0.05),而干擾Mark4組呈現(xiàn)相反趨勢,說明Mark4促進Rapa誘導(dǎo)的脂肪細胞自噬。進一步研究發(fā)現(xiàn)超表達Mark4抑制m TOR以及其下游靶分子S6K的磷酸化變化(P0.05),但是AMPK/AKT磷酸化水平?jīng)]有變化,說明Mark4通過抑制mTOR信號通路促進雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬發(fā)生,這一過程不依賴AMPK/AKT信號通路。3.Mark4通過調(diào)控自噬影響白脂棕色化:冷刺激顯著降低WAT中Mark4、Beclin1、ATG7表達,顯著提高UCP1、PGC1a、Prdm16、Cidea的表達(P0.05)。冷刺激顯著降低BAT中Mark4表達,伴隨著Beclin1、ATG7及UCP1、PGC1a、Prdm16、Cidea表達水平升高(P0.05)。HFD飼喂條件下,不管WAT還是BAT中,Mark4表達水平都是顯著升高的(P0.05)。WAT中Beclin1、ATG7表達水平顯著升高(P0.05),UCP1、PGC1a、Cidea、Prdm16表達水平均沒有顯著變化(P0.05)。HFD條件下BAT中Beclin1、ATG7及UCP1、PGC1a、Cidea、Prdm16表達水平顯著增加(P0.05)。超表達Mark4給予3-MA處理后,UCP1、PGC1a、Prdm16、Cidea的表達均未達到顯著水平(P0.05),而干擾組顯著促進UCP1、PGC1a、Prdm16、Cidea的表達(P0.05)。油紅O染色發(fā)現(xiàn),干擾Mark4給予3-MA處理脂滴變小、變少,說明Mark4通過抑制自噬調(diào)控白脂棕色化相關(guān)因子表達。綜上所述,本研究成功構(gòu)建饑餓和Rapa兩種脂肪細胞自噬模型,明確Mark4通過激活A(yù)MPK,抑制AKT/mTOR信號通路促進自噬發(fā)生并闡明其調(diào)控機理,進一步證實Mark4促進自噬抑制白脂棕色化相關(guān)因子表達。
【關(guān)鍵詞】：Mark4 3T3-L1脂肪細胞 自噬 白脂棕色化
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q591
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 文獻綜述13-26
• 第一章 MARK4概述13-16
• 1.1 MARKS家族來源與結(jié)構(gòu)13
• 1.2 MARKS家族功能13-14
• 1.3 MARK4結(jié)構(gòu)14-15
• 1.4 MARK4功能研究15-16
• 第二章 自噬研究進展16-22
• 2.1 自噬種類16-18
• 2.2 自噬調(diào)節(jié)機制18-20
• 2.2.1 自噬體膜來源18-19
• 2.2.2 自噬體成熟19
• 2.2.3 其他調(diào)節(jié)分子19-20
• 2.3 自噬與脂代謝關(guān)系20-22
• 第三章 白脂棕色化研究進展22-26
• 3.1 三類脂肪組織22
• 3.2 調(diào)節(jié)白脂、棕脂和米脂分化的因子22-23
• 3.3 白脂棕色化相關(guān)研究23-26
• 試驗研究26-55
• 前言26-27
• 第四章 MARK4促進饑餓誘導(dǎo)的脂肪細胞自噬27-39
• 4.1 材料27-28
• 4.1.1 細胞27-28
• 4.1.2 主要試劑及設(shè)備儀器28
• 4.2 方法28-31
• 4.2.1 3T3-L1脂肪細胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存28
• 4.2.2 細胞誘導(dǎo)分化28-29
• 4.2.3 油紅O染色29
• 4.2.4 CCK8檢測細胞活性29
• 4.2.5 質(zhì)粒載體提取29
• 4.2.6 質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染29
• 4.2.7 細胞總RNA提取29-30
• 4.2.8 反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR30-31
• 4.2.9 細胞總蛋白提取31
• 4.2.10 Western Blot檢測31
• 4.2.11 MDC染色31
• 4.2.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析31
• 4.3 結(jié)果與分析31-37
• 4.3.1 構(gòu)建血清饑餓誘導(dǎo) 3T3-L1脂肪細胞自噬模型31-33
• 4.3.2 Mark4調(diào)控血清饑餓誘導(dǎo)的自噬33-35
• 4.3.3 Mark4調(diào)控血清饑餓誘導(dǎo)的自噬的分子機制35-37
• 4.4 討論37-38
• 4.5 小結(jié)38-39
• 第五章 MARK4促進雷帕霉素誘導(dǎo)的脂肪細胞自噬39-47
• 5.1 材料39
• 5.1.1 細胞39
• 5.1.2 主要試劑設(shè)備儀器39
• 5.2 方法39-40
• 5.2.13T3-L1脂肪細胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存39
• 5.2.2 細胞誘導(dǎo)分化與油紅O染色39
• 5.2.3 CCK8檢測細胞活性39-40
• 5.2.4 質(zhì)粒載體提取與轉(zhuǎn)染40
• 5.2.5 細胞總RNA提取40
• 5.2.6 反轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR40
• 5.2.7 細胞總蛋白提取40
• 5.2.8 Western Blot檢測40
• 5.2.9 MDC染色40
• 5.2.10數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析40
• 5.3 結(jié)果與分析40-45
• 5.3.1 構(gòu)建Rapa誘導(dǎo) 3T3-L1脂肪細胞自噬模型40-42
• 5.3.2 Mark4調(diào)控Rapa誘導(dǎo)的脂肪細胞自噬42-44
• 5.3.3 Mark4調(diào)控Rapa誘導(dǎo)的脂肪細胞自噬的分子機制44-45
• 5.4 討論45-46
• 5.5 小結(jié)46-47
• 第六章 MARK4通過調(diào)控脂肪細胞自噬影響白脂棕色化47-55
• 6.1 材料47
• 6.1.1 細胞、小鼠47
• 6.1.2 主要試劑47
• 6.1.3 設(shè)備儀器47
• 6.2 方法47-48
• 6.2.1 小鼠飼養(yǎng)管理47
• 6.2.2 3T3-L1脂肪細胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存47-48
• 6.2.3 細胞誘導(dǎo)分化與油紅O染色48
• 6.2.4 質(zhì)粒載體提取與轉(zhuǎn)染48
• 6.2.5 細胞總RNA提取48
• 6.2.6 反轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR48
• 6.2.7 細胞總蛋白提取48
• 6.2.8 Western Blot檢測48
• 6.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析48
• 6.3 結(jié)果48-53
• 6.3.1 冷刺激影響白脂和棕脂中Mark4、自噬因子及白脂棕色化相關(guān)因子表達48-49
• 6.3.2 HFD影響白脂和棕脂中Mark4、自噬因子及白脂棕色化相關(guān)因子表達49-50
• 6.3.3 Mark4對抑制自噬條件下脂滴變化的影響50-51
• 6.3.4 Mark4影響白脂棕色化相關(guān)因子表達（饑餓誘導(dǎo)自噬模型）51-52
• 6.3.5 Mark4影響白脂棕色化相關(guān)因子表達（Rapa誘導(dǎo)自噬模型）52-53
• 6.4 討論53-54
• 6.5 小結(jié)54-55
• 結(jié)論、創(chuàng)新點以及進一步研究內(nèi)容55-56
• 1 結(jié)論55
• 2 創(chuàng)新點55
• 3 進一步研究內(nèi)容55-56
• 參考文獻56-64
• 附錄64-69
• 致謝69-70
• 作者簡介70

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