本文關(guān)鍵詞：山羊源奇異變形桿菌的分離鑒定及其主要毒力基因的檢測

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【摘要】：奇異變形桿菌(Proteus mirabilis,PM)是一種人畜均可感染的條件性致病菌,感染宿主范圍廣,山羊、豬、雞、犢牛、狐貍、獼猴、水貂、鴿子、各種魚類等多種畜禽和野生動物均可感染。PM可引起人的食物中毒和尿道感染,而感染其他動物上會發(fā)生不同的疾病,主要有腹瀉、創(chuàng)傷感染,也有中耳炎、腹膜炎、腦膜炎的報道。PM屬于兼性厭氧菌,并且對生長環(huán)境要求不高,低溫條件下也可繁殖,極易對動物性食品造成污染,引起人的食物中毒,具有十分重要的衛(wèi)生學意義。但直到本世紀70年代末期,PM對動物的致病性才受到研究者的關(guān)注,從病原學、流行病學等方面做了不同程度的研究。近幾年,我國奇異變形桿菌感染人和動物的報道呈上升的趨勢,對于畜禽養(yǎng)殖業(yè)和人的健康安全造成了極大的危害。山羊腹瀉是臨床常見病和多發(fā)病,導致山羊腹瀉的因素有很多,其中細菌、病毒和寄生蟲感染是引起山羊腹瀉的主要原因。本實驗室在前期對成都某羊場的腹瀉山羊進行了病原檢測,發(fā)現(xiàn)奇異變形桿菌與山羊腹瀉有密切關(guān)系。但目前國內(nèi)外對山羊源奇異變形桿菌的病原學研究資料甚少,為深入了解其生物學特性,為有效控制其感染提供科學依據(jù),本研究對山羊源奇異變形桿菌進行分離鑒定、對其部分生物學特征進行了研究,并對PM部分毒力基因進行PCR檢測,取得如下結(jié)果。1山羊源PM的分離鑒定 1.1山羊源PM的培養(yǎng)特性、染色及形態(tài)從四川5個地區(qū)青白江、簡陽、西昌、攀枝花、北川等地7個羊場采集腹瀉和健康山羊糞便棉拭子各140份,分別接種于BPW中37℃預(yù)增菌培養(yǎng)12h,轉(zhuǎn)種于SC增菌液,37℃培養(yǎng)18h,最后轉(zhuǎn)接種于SS瓊脂培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)12h。在SS瓊脂培養(yǎng)基上可見光滑、扁平有黑色中心的透明或半透明圓形大菌落,在lb平板上可見典型的“遷徙”生長現(xiàn)象,細菌呈擴散狀生長。挑選疑似菌落革蘭氏染色鏡檢,可見革蘭氏陰性中等大小的桿菌,無莢膜,不形成芽孢。1.2pcr鑒定挑選疑似菌落接種lb培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)12h,用酚氯仿法提取總dna,采用靶向奇異變形桿菌脲酶調(diào)節(jié)因子(urer)的引物,擴增其225bp的特異片段,隨機挑選5個陽性擴增產(chǎn)物膠回收,連接t載體并測序,證實為pm特異片段。共鑒定出pm41株,其中從腹瀉山羊糞便樣本中檢出31株(31/140),從健康山羊糞便中檢出10株(10/140)。用spss軟件進行統(tǒng)計學處理,腹瀉樣本中pm的檢出率顯著高于健康糞便樣本(p=0.02)。由此可見pm與山羊腹瀉關(guān)系密切。2山羊源pm的耐藥性檢測采用k-b法檢測20株山羊源pm對青霉素類、磺胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類、頭孢類、β-內(nèi)酰胺類等6大類共15種常用抗菌藥物(鏈霉素、復方新諾明、諾氟沙星、萘啶酸、頭孢吡肟、頭孢噻吩、阿莫西林、氨芐西林、慶大霉素、卡那霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、頭孢他啶和阿米卡星)的抗性。結(jié)果顯示:20株被檢pm分離株對上述藥物的耐藥率分別為30%、35%、15%、100%、100%、85%、100%、40%、90%、100%、100%、100%、95%、100%、100%。耐藥譜為9~13耐,說明山羊pm的耐藥性十分嚴重,且不同地區(qū)山羊奇異變形桿菌的耐藥譜和耐藥率差異顯著(攀枝花地區(qū)普遍對青霉素類耐藥,簡陽地區(qū)普遍對β-內(nèi)酰胺類耐藥),這與不同地區(qū)羊場的用藥習慣有關(guān)。因此,定期開展藥敏試驗,能為山羊pm感染的預(yù)防和治療提供可靠的用藥指導。3山羊源pm的致病性隨機挑選5株(編號pm1~pm5)從山羊腹瀉糞便中分離的pm,分別接種于lb肉湯,37℃培養(yǎng)12h,采用比濁法計數(shù),調(diào)整菌液濃度至5×108cfu/ml,腹腔注射2月齡雌性spf昆系小鼠,0.2ml/只,每個菌株接種5只小鼠,同時設(shè)5只空白對照,以滅菌生理鹽水代替肉湯培養(yǎng)物,各組小鼠隔離飼養(yǎng),自由采食和飲水,密切觀察并紀錄小鼠發(fā)病及死亡情況。結(jié)果顯示:空白組5只小鼠在整個試驗期間健康狀態(tài)良好。而5個PM感染組小鼠在8h左右均出現(xiàn)精神沉郁、反應(yīng)遲鈍,閉目蜷縮、扎堆顫抖等癥狀,10 h開始出現(xiàn)死亡,24 h內(nèi)全部死亡。死亡小鼠剖檢均可見腸管出現(xiàn)明顯的充盈、膨脹、腸道內(nèi)充滿黃色粥樣稀液內(nèi)容物,脾臟出現(xiàn)程度不同的腫脹,心臟、肝臟等其他實質(zhì)器官未見明顯病變。上述結(jié)果說明,腹腔接種PM對小鼠具有較強的致病性。4山羊源PM主要毒力因子的檢測研究和鑒定細菌的毒力基因是研究其感染與致病機理的重要研究內(nèi)容。本研究選取尿素酶的功能亞單位編碼的ureC基因、由金屬蛋白酶的主要功能亞單位編碼的zapA基因、由MPR菌毛主要結(jié)構(gòu)亞單位編碼的mrpA基因、由尿道上皮粘附素結(jié)構(gòu)亞單位編碼的ucaA基因、由“霧蔓”遷徙能力的調(diào)節(jié)基因編碼的rsbA基因、由Pmf菌毛主要結(jié)構(gòu)亞單位編碼的pmfA基因、由適溫菌毛結(jié)構(gòu)亞單位編碼的atfA基因、由適溫菌毛合成的分子引物編碼的atfC基因等8個毒力基因,參照文獻報道分別合成這8個毒力基因的引物,PCR分別檢測8個毒力基因在10株分自健康山羊糞便樣本和20株來自腹瀉山羊糞便的PM的攜帶情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):ureC基因在健康山羊和腹瀉山羊PM分離株的攜帶率分別為60%(6/10)和80%(16/20);zap A基因在健康山羊和腹瀉山羊PM分離株的攜帶率分別為50%(5/10),和85%(17/20),經(jīng)過spss軟件進行統(tǒng)計學處理,2個基因在健康山羊和腹瀉山羊源PM的攜帶率差異顯著(P=0.04、0.02)。而mrpA、ucaA、rsbA、pmfA、atfA、atfC基因在健康和腹瀉山羊中的檢出率無明顯差異。因此可見,PM攜帶的ureC和zapA基因可能與致山羊腹瀉有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：山羊 奇異變形桿菌 腹瀉 毒力因子 藥敏試驗 耐藥性 致病性
【學位授予單位】：西南民族大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 第一篇 文獻綜述 畜禽奇異變形桿菌病的研究進展13-20
• 1 分類地位及形態(tài)特征13-14
• 2 培養(yǎng)特性14
• 3 病原性14-15
• 4 耐藥性15-16
• 5 分子生物學特征16-17
• 5.1 耐藥基因16
• 5.2 毒力基因16-17
• 6 流行病學研究進展17-18
• 6.1 奇異變形桿菌的感染譜17
• 6.2 傳播途徑17
• 6.3 臨床癥狀及病理變化17-18
• 6.4 診斷18
• 7 問題與展望18-20
• 第二篇 研究報告20-41
• 第一章 山羊奇異變形桿菌的分離鑒定及部分生物學特征研究20-33
• 1 材料和方法20-23
• 1.1 樣本采集20
• 1.2 發(fā)病情況20-21
• 1.3 實驗動物與菌株21
• 1.4 主要試劑和儀器設(shè)備21
• 1.5 PM的分離培養(yǎng)21
• 1.6 菌體形態(tài)和染色特性21
• 1.7 PCR鑒定21-22
• 1.8 耐藥表型22
• 1.9 致病性試驗22-23
• 1.9.1 菌液的準備22-23
• 1.9.2 動物接種23
• 2 結(jié)果23-30
• 2.1 PM的培養(yǎng)特征23-24
• 2.2 PM的形態(tài)及染色特征24-25
• 2.3 PCR鑒定結(jié)果25-26
• 2.4 PM的耐藥表型26-29
• 2.5 PM對小鼠的致病性29-30
• 3 討論30-33
• 第二章 山羊奇異變形桿菌8種毒力因子的分布研究33-41
• 1 材料與方法33-35
• 1.1 菌株33
• 1.2 主要試劑33
• 1.3 主要儀器33-34
• 1.4 引物設(shè)計與合成34
• 1.5 PM DNA的提取34-35
• 1.6 PCR擴增PM毒力基因35
• 2 結(jié)果35-39
• 2.1 山羊毒力因子的PCR擴增結(jié)果35-38
• 2.2 山羊PM毒力基因的分布38-39
• 3 討論39-41
• 結(jié)論與創(chuàng)新點41-42
• 參考文獻42-49
• 致謝49-50

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