發(fā)布時(shí)間：2017-09-21 13:40

  本文關(guān)鍵詞：基于日本沼蝦轉(zhuǎn)錄組的免疫基因發(fā)掘

  更多相關(guān)文章： 日本沼蝦 轉(zhuǎn)錄組文庫(kù) 免疫相關(guān)基因

【摘要】：日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)是我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)蝦類(lèi)。因其培養(yǎng)周期短,市場(chǎng)價(jià)格高而備受水產(chǎn)養(yǎng)殖戶(hù)的青睞。但是近年日本沼蝦細(xì)菌性疾病的頻發(fā)已給其養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失,而目前缺乏日本沼蝦分子免疫機(jī)制的研究。因此從分子生物學(xué)水平上研究日本沼蝦免疫防御機(jī)制,對(duì)養(yǎng)殖過(guò)程中的疾病防控有重要的意義。本研究以日本沼蝦為研究對(duì)象,利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù),成功測(cè)定了1個(gè)轉(zhuǎn)錄組和4對(duì)細(xì)菌刺激后不同時(shí)間不同組織的數(shù)字基因表達(dá)譜(DGE)。利用blastx算法將獲得的日本沼蝦轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)分別在COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swissprot和nr等七大公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能和代謝途徑分析注釋,并對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物中一些重要的免疫基因進(jìn)行了篩選。同時(shí)我們對(duì)4對(duì)表達(dá)譜數(shù)據(jù)在組織水平和時(shí)間水平上分類(lèi)比較,以期明確日本沼蝦免疫基因表達(dá)的時(shí)空特異性,這個(gè)工作有助于從分子生物學(xué)水平上揭示日本沼蝦的免疫機(jī)制。在轉(zhuǎn)錄組分析過(guò)程中,我們從日本沼蝦中鑒定了脊椎動(dòng)物腫瘤壞死因子(TNF)和脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子(Litaf)的同源基因MnTNF和Mn Litaf,并對(duì)其在細(xì)菌刺激下的表達(dá)進(jìn)行了定量分析。主要結(jié)果如下:1.成功構(gòu)建了日本沼蝦轉(zhuǎn)錄組文庫(kù),獲得unigenes共142560條,共有43038條基因得到注釋,占轉(zhuǎn)錄組總unigenes的30.20%,通過(guò)注釋信息和手動(dòng)篩選找到1240條潛在的免疫相關(guān)基因,這些基因主要屬于模式識(shí)別受體、免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和免疫效應(yīng)因子。在其他甲殼綱中普遍存在的dFADD和Dredd等保守免疫基因在日本沼蝦轉(zhuǎn)錄組中沒(méi)有找到。根據(jù)免疫基因的篩選結(jié)果,初步繪制了日本沼蝦免疫通路圖。2.比較日本沼蝦不同組織和細(xì)菌刺激后不同時(shí)間的表達(dá)譜,進(jìn)行免疫相關(guān)基因DEG(Differentially Expressed Gene)分析,鑒定了在血細(xì)胞和肝胰腺中特異表達(dá)的免疫基因,以及細(xì)菌刺激后差異表達(dá)的免疫基因,初步明確了日本沼蝦免疫基因表達(dá)的時(shí)空特異性。3.首次在蝦類(lèi)中鑒定到TNF超家族成員MnTNF,定量分析結(jié)果顯示其在鰓中的表達(dá)量最高;對(duì)MnTNF上游潛在轉(zhuǎn)錄因子MnLitaf進(jìn)行定量分析,結(jié)果顯示其在血細(xì)胞中高表達(dá)。在細(xì)菌刺激后二者表達(dá)量均顯著上調(diào),暗示這兩個(gè)基因在日本沼蝦的免疫應(yīng)答中均扮演重要角色。綜上所述,本研究豐富了日本沼蝦的遺傳數(shù)據(jù)庫(kù),為日本沼蝦的疾病防御和健康養(yǎng)殖提供了理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：日本沼蝦 轉(zhuǎn)錄組文庫(kù) 免疫相關(guān)基因
【學(xué)位授予單位】：河北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 文獻(xiàn)綜述12-23
• 1.1 日本沼蝦簡(jiǎn)介12
• 1.2 無(wú)脊椎動(dòng)物的防御機(jī)制12-19
• 1.2.1 非己識(shí)別13-15
• 1.2.2 免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)15-18
• 1.2.3 效應(yīng)因子反應(yīng)系統(tǒng)18-19
• 1.3 TNF與Litaf研究進(jìn)展19-21
• 1.4 本研究的目的和意義21-23
• 第2章 日本沼蝦轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序及分析23-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-25
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株23
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理23
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器23-24
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)樣品處理24
• 2.1.5 日本沼蝦總RNA提取24
• 2.1.6 測(cè)序文庫(kù)制備24
• 2.1.7 序列拼接組裝24-25
• 2.1.8 unigene功能注釋和分類(lèi)25
• 2.1.9 重要免疫基因的篩選和比較25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-32
• 2.2.1 序列組裝拼接25-26
• 2.2.2 日本沼蝦總轉(zhuǎn)錄組的功能注釋26-30
• 2.2.3 免疫相關(guān)基因篩選與分析30-32
• 2.3 討論32-34
• 第3章 細(xì)菌刺激下的基因表達(dá)譜分析34-46
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料34
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法34-35
• 3.2.1 FPKM標(biāo)準(zhǔn)化處理34
• 3.2.2 免疫基因的組織特異性表達(dá)分析34
• 3.2.3 細(xì)菌刺激后血細(xì)胞中差異表達(dá)的基因分析34
• 3.2.4 細(xì)菌刺激后肝胰腺中差異表達(dá)的基因分析34-35
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-43
• 3.3.1 組織特異性表達(dá)的免疫基因35-38
• 3.3.2 細(xì)菌刺激后血細(xì)胞中差異表達(dá)基因的分析38-40
• 3.3.3 細(xì)菌刺激后肝胰腺中差異表達(dá)基因的分析40-43
• 3.4 討論43-46
• 第4章 MnLitaf基因的擴(kuò)增與表達(dá)分析46-55
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料46-47
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象46
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器46
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑46-47
• 4.1.4 實(shí)驗(yàn)引物47
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法47-48
• 4.2.1 取材、總RNA提取和cDNA的合成47
• 4.2.2 日本沼蝦Litaf（Mn Litaf）基因的擴(kuò)增47-48
• 4.2.3 生物信息學(xué)分析48
• 4.2.4 日本沼蝦Litaf（Mn Litaf）的組織表達(dá)量分析48
• 4.2.5 日本沼蝦Litaf（Mn Litaf）細(xì)菌刺激后的表達(dá)分析48
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果48-54
• 4.3.1 日本沼蝦Litaf（Mn Litaf）的擴(kuò)增與序列分析48-49
• 4.3.2 日本沼蝦MnLitaf的生物信息學(xué)分析49-52
• 4.3.3 日本沼蝦MnLitaf的系統(tǒng)進(jìn)化分析52-53
• 4.3.4 MnLitaf的組織表達(dá)量分析53
• 4.3.5 細(xì)菌刺激后MnLitaf在血細(xì)胞的表達(dá)量分析53-54
• 4.4 討論54-55
• 第5章 MnTNF基因的擴(kuò)增與表達(dá)分析55-62
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料55
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法55-56
• 5.2.1 日本沼蝦總RNA提取和cDNA的合成55-56
• 5.2.2 日本沼蝦TNF（MnTNF）基因的擴(kuò)增56
• 5.2.3 生物信息學(xué)分析56
• 5.2.4 日本沼蝦TNF（MnTNF）的組織表達(dá)量分析56
• 5.2.5 日本沼蝦TNF（MnTNF）細(xì)菌刺激后的表達(dá)分析56
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果56-61
• 5.3.1 日本沼蝦TNF（MnTNF）的擴(kuò)增與序列分析56-58
• 5.3.2 日本沼蝦MnTNF的生物信息學(xué)分析58
• 5.3.3 日本沼蝦MnTNF的系統(tǒng)進(jìn)化分析58-60
• 5.3.4 MnTNF的組織表達(dá)量分析60
• 5.3.5 細(xì)菌刺激后MnTNF在血細(xì)胞的表達(dá)量分析60-61
• 5.4 討論61-62
• 結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-70
• 致謝70-71
• 讀研期間發(fā)表的論文71

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