本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因水稻T-DNA側(cè)翼序列的擴增與分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

      在利用特異引物和隨機引物進(jìn)行PCR中一般有3種產(chǎn)物生成： ①由特異性引物和簡并引物擴增出的產(chǎn)物； ②由同一特異性引物擴增出的產(chǎn)物； ③由同一簡并引物擴增出的產(chǎn)物。

      種目標(biāo)產(chǎn)物可以通過以嵌套的特異性引物進(jìn)行的后續(xù)反應(yīng)來消除。

      第二次反應(yīng)則將第一級反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋1000倍作為模板，通過10次熱不對稱的超級循環(huán)，使特異性產(chǎn)物被選擇地擴增，而非特異產(chǎn)物含量極低。

      第三次反應(yīng)又將第二次反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋作模板，再設(shè)置普通的PCR反應(yīng)或熱不對稱超級循環(huán)，通過上述3次PCR反應(yīng)可獲得與已知序列鄰近的目標(biāo)序列。

      Tail-PCR的技術(shù)優(yōu)點及技術(shù)難點。

      Tail-PCR技術(shù)的優(yōu)點：

1）簡單。只要設(shè)計好引物，即可以用基因組DNA作模板直接篩選到目標(biāo)序列，節(jié)省了PCR反應(yīng)前后的許多費時，費力的操作程序。

2）特異性高。用短的簡并引物和長的特異性嵌套引物相組合，通過不對稱的溫度循環(huán)和分級反應(yīng)，使反應(yīng)體系有利于特異引物的擴增，最終的擴增產(chǎn)物中目的片段占絕對優(yōu)勢，反應(yīng)產(chǎn)物可以直接用作探針標(biāo)記和測序模板。

3）高效靈敏。使用任何一個簡并引物，在60％-80％的反應(yīng)中能夠產(chǎn)生特異性產(chǎn)物。

4）快速。整個Tail-PCR反應(yīng)循環(huán)能夠在1天內(nèi)完成，可以快速地獲得目標(biāo)片段。

5）不涉及連接反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好。

      但是，，Tail-PCR反應(yīng)需要較多的引物組合，并且由于簡并引物存在有限的結(jié)合位點，對于個別的側(cè)翼序列，即使使用不同的簡并引物也難以擴增到陽性結(jié)果。整個Tail-PCR需要一系列連續(xù)的反應(yīng)，反應(yīng)條件的設(shè)置要求比較精細(xì)。

[1] Liu Yao- Guang,Robert F Whitter. Thermal asymmetric interlaced PC R:automatable amplification and sequencing of insert end fragment from Pl and YAC clones for chromosome walking[ J] . Genomics,1995 ,25 :674一681

[2」Liu Yao- Guang，Huang Ning.Efficient amplification of insert end sequences from bacterial artificial chromosome clones by thermal asym-metric interlaced PC風(fēng)J] Plant Molecular Biology Reporter,1998 ,16(2) :175一181

[3] 方進(jìn)，瞿文學(xué)，王文明,等. 轉(zhuǎn)基因水稻T-DNA側(cè)翼序列的擴增與分析[J]. 遺傳學(xué)報，2001，2（4）：345－357

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