本文關(guān)鍵詞：ABA代謝關(guān)鍵基因調(diào)控桃休眠的分子機(jī)制研究

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【摘要】：試驗(yàn)于2013-2015年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家蘋果工程中心、作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及山東省果樹研究所(泰安)進(jìn)行,以‘中油4號(hào)’(Prunus persica var.nectariana cv.Zhongyousiha)油桃為實(shí)驗(yàn)材料,通過同源比對(duì)的方式查找桃樹基因組中調(diào)控ABA代謝的關(guān)鍵基因,利用realtime PCR技術(shù)檢測(cè)ABA代謝關(guān)鍵基因在種子休眠以及芽休眠過程中的表達(dá)模式,然后比較異同。另外,我們還成功克隆了3個(gè)控制ABA分解的CYP707A基因家族成員,并成功誘導(dǎo)表達(dá)了其相應(yīng)的蛋白,為以后進(jìn)一步研究ABA8’-羥化酶的蛋白奠定了基礎(chǔ),同時(shí)獲得桃CYP707A家族3個(gè)基因的過表達(dá)擬南芥植株。主要結(jié)果如下:(1)通過擬南芥中ABA代謝相關(guān)基因(ZEP,NCED,AAO,CYP707A,SDR1)的蛋白序列同源比對(duì)桃樹基因組,根據(jù)保守性分析刪除冗余序列,最終在桃樹基因組中得到4個(gè)NCED家族基因類似成員、1個(gè)AAO基因家族成員、3個(gè)CYP707A家族基因成員,以及ZEP和SDR1的同源基因。(2)通過定量分析研究桃中ABA代謝相關(guān)基因在花芽以及葉芽休眠過程中的的表達(dá)模式,我們發(fā)現(xiàn)ABA代謝相關(guān)基因在葉芽和花芽休眠過程中具有相同的表達(dá)模式,其中,NCED家族基因在芽的休眠誘導(dǎo)以及深休眠階段起到重要的調(diào)控作用,PpCYP707A2和PpCYP707A3在芽休眠解除階段起到重要的調(diào)控作用。(3)利用熒光定量方法研究了桃中ABA代謝相關(guān)基因在種子休眠過程中的表達(dá)模式。結(jié)果顯示,NCED家族成員在種子發(fā)育過程(種子休眠誘導(dǎo))中表達(dá)水平逐漸升高,PpCYP707A2和PpCYP7073在種子休眠解除階段表達(dá)量驟然升高,這與芽休眠的變化趨勢(shì)是一致的,說(shuō)明ABA控制芽休眠以及種子休眠存在著一定的共通性。(4)利用plantCARE在線啟動(dòng)子分析軟件對(duì)桃中CYP707A家族3個(gè)基因的啟動(dòng)子進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,這些基因的啟動(dòng)子都含有ABRE-motif和GARE-motif。利用GA3和ABA處理桃花芽后,只有PpCYP707A2能夠被GA3和ABA所誘導(dǎo)。(5)構(gòu)建正義植物表達(dá)載體PBI121-PpCYP707A1、PBI121-PpCYP707A2、PBI121-PpCYP707A3,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法,轉(zhuǎn)化擬南芥,同時(shí)轉(zhuǎn)空載體作為對(duì)照。經(jīng)卡那霉素篩選獲得若干再生植株,PCR鑒定發(fā)現(xiàn)PpCYP707A1、PpCYP707A2、PpCYP707A3在擬南芥中得到成功表達(dá)。(6)構(gòu)建原核表達(dá)載體PGST-PpCYP707A1、PGST-PpCYP707A2,并且將重組表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,成功誘導(dǎo)純化了PpCYP707A1和PpCYP707A2蛋白,SDS-PAGE電泳結(jié)果表明,表達(dá)蛋白與預(yù)期蛋白大小一致。
【關(guān)鍵詞】：休眠 芽 種子 CYP707A ABA
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S662.1
【目錄】：

• 符號(hào)說(shuō)明4-9
• 中文摘要9-11
• Abstract11-13
• 1 前言13-27
• 1.1 芽休眠13-19
• 1.1.1 芽休眠的定義以及分類13-14
• 1.1.2 芽休眠進(jìn)程的確定14
• 1.1.3 環(huán)境因子在芽休眠過程中的調(diào)節(jié)作用14-16
• 1.1.4 休眠分子機(jī)制的研究方法16
• 1.1.5 芽休眠過程中的分子機(jī)制16-18
• 1.1.6 植物激素與芽休眠18-19
• 1.2 種子休眠19-25
• 1.2.1 種子休眠的誘導(dǎo)20-23
• 1.2.2 種子休眠的解除23-25
• 1.3 ABA的代謝途徑25
• 1.4 ABA8′-羥化酶在植物中的作用25-27
• 2 材料與方法27-43
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與處理27-29
• 2.1.1 試驗(yàn)材料27
• 2.1.2 載體和菌株27
• 2.1.3 生化試劑27
• 2.1.4 儀器設(shè)備27-29
• 2.1.5 引物的合成及測(cè)序29
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法29-43
• 2.2.1 樣品采集29
• 2.2.2 GA_3處理成熟桃種子29
• 2.2.3 桃種子冷藏處理29
• 2.2.4 桃種子萌芽率測(cè)試29-30
• 2.2.5 桃休眠進(jìn)程的界定30
• 2.2.6 不同破眠劑處理休眠中的桃芽30
• 2.2.7 GA_3和ABA分別處理休眠中的桃芽30
• 2.2.8 鑒定桃中ABA代謝相關(guān)基因30-31
• 2.2.9 桃組織DNA的提取31
• 2.2.10 桃組織RNA的提取31-32
• 2.2.11 cDNA第一條鏈的獲取32-33
• 2.2.12 熒光定量PCR33-34
• 2.2.13 高保真酶擴(kuò)增目的基因34
• 2.2.14 PCR產(chǎn)物的回收34-35
• 2.2.15 TA克隆35
• 2.2.16 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備35-36
• 2.2.17 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化36
• 2.2.18 菌落PCR36-37
• 2.2.19 質(zhì)粒提取37-38
• 2.2.20 植物表達(dá)載體的構(gòu)建38
• 2.2.21 農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞的制備38-39
• 2.2.22 凍融法轉(zhuǎn)化LBA4404農(nóng)桿菌感受態(tài)39
• 2.2.23 擬南芥轉(zhuǎn)化39-40
• 2.2.24 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)40
• 2.2.25 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)40-41
• 2.2.26 ABA含量的測(cè)定41-43
• 3 結(jié)果與分析43-60
• 3.1 ABA代謝關(guān)鍵基因在桃芽休眠以及種子休眠過程中的表達(dá)模式分析43-54
• 3.1.1 桃基因組中ABA代謝相關(guān)基因的鑒定43-44
• 3.1.2 桃基因組中ABA代謝相關(guān)基因的進(jìn)化樹分析44-46
• 3.1.3 桃花芽和桃葉芽休眠狀態(tài)的確定46-47
• 3.1.4 ABA代謝關(guān)鍵基因在桃花芽和葉芽休眠過程中的表達(dá)模式分析47-48
• 3.1.5 ABA代謝關(guān)鍵基因在種子發(fā)育過程中的表達(dá)模式分析48-50
• 3.1.6 ABA代謝關(guān)鍵基因在種子層積過程中的表達(dá)模式分析50-52
• 3.1.7 赤霉素對(duì)種子中ABA代謝關(guān)鍵基因的作用52-53
• 3.1.8 不同的破眠劑對(duì)深休眠期桃花芽的破眠影響53-54
• 3.2 CYP707A家族基因的克隆與功能驗(yàn)證54-60
• 3.2.1 PpCYP707As的基因克隆以及基因組結(jié)構(gòu)分析54
• 3.2.2 PpCYP707As正義表達(dá)載體的構(gòu)建54-55
• 3.2.3 PpCYP707As正義表達(dá)載體正義轉(zhuǎn)化擬南芥55-56
• 3.2.4 CYP707A基因家族成員啟動(dòng)子克隆以及GUS染色56-57
• 3.2.5 PpCYP707As的組織特異性分析57
• 3.2.6 PpCYP707As在花芽休眠過程中的特異性分析57-58
• 3.2.7 不同處理對(duì)桃花芽中CYP707A基因家族成員的表達(dá)調(diào)控58-59
• 3.2.8 PpCYP707A1和PpCYP707A2蛋白原核表達(dá)59-60
• 4 討論60-65
• 4.1 ABA代謝通路在調(diào)控葉芽和花芽中的作用60-61
• 4.2 ABA代謝關(guān)鍵基因的高水平表達(dá)與種子休眠的誘導(dǎo)有關(guān)61-63
• 4.3 種子休眠的解除與ABA代謝基因的關(guān)系63-64
• 4.4 芽休眠和種子休眠是不同的但存在一定共同的調(diào)控機(jī)制64-65
• 5 結(jié)論65-66
• 參考文獻(xiàn)66-81
• 致謝81-82
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文82-83
• 附件83

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 譚鉞;冷傳遠(yuǎn);李玲;徐臣善;陳修德;高東升;;高溫和單氰胺對(duì)油桃休眠花芽呼吸代謝的影響[J];應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào);2012年09期

2 李玲;譚鉞;王慧;冷傳遠(yuǎn);李冬梅;陳修德;高東升;;桃花芽自然休眠期間水孔蛋白基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[J];應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào);2011年11期

3 李茜茜;汪曉峰;;ABA分解代謝及其代謝關(guān)鍵酶—8′-羥化酶[J];廣西植物;2009年03期

4 段成國(guó),李憲利,高東升,劉煥芳,李萌;內(nèi)源ABA和GA_3對(duì)歐洲甜櫻桃花芽自然休眠的調(diào)控[J];園藝學(xué)報(bào);2004年02期

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本文編號(hào)：874678